Ceux qu’on prenait pour des musulmans.

Le « musulman » dans les camps de concentration nazis est celui qui tombe d’épuisement, infiniment résigné, prêt à mourir …

Ceux qu’on prenait pour des musulmans dans les camps de concentration (Primo Levi : Si c’est un homme).

            « Mais au Lager il en va tout autrement : ici, la lutte pour la vie est implacable car chacun est désespérément et férocement seul. Si un quelconque Null Achtzehn vacille, il ne trouvera personne pour lui tendre la main, mais bien quelqu’un qui lui donnera le coup de grâce, parce que ici personne n’a intérêt à ce qu’un « musulman » de plus se traîne chaque jour au travail ; et si quelqu’un, par un miracle de patience et d’astuce, trouve une nouvelle combine pour échapper aux travaux les plus durs, un nouveau système qui lui rapporte quelques grammes de pain supplémentaires, il gardera jalousement son secret, ce qui lui vaudra la considération et le respect général, et lui rapportera un avantage strictement personnel ; il deviendra plus puissant, on le craindra, et celui qui se fait craindre est du même coup un candidat à la survie.

            On a parfois l’impression qu’il émane de l’histoire et de la vie une loi féroce que l’on pourrait énoncer ainsi : « Il sera donné à celui qui possède, il sera pris à celui qui n’a rien » Au Lager, où l’homme est seul et où la lutte pour la vie se réduit à son mécanisme primordial, la loi inique est ouvertement en vigueur et unanimement reconnue. Avec ceux qui ont su s’adapter, avec les individus forts et rusés, les chefs eux-mêmes entretiennent volontiers des rapports, parfois presque amicaux, dans l’espoir qu’ils pourront peut-être plus tard en tirer parti. Mais « les musulmans », les hommes en voie de désintégration, ceux-là ne valent même pas la peine qu’on leur adresse la parole, puisqu’on sait d’avance qu’ils commenceraient à se plaindre et à parler de ce qu’ils mangeaient quand ils étaient chez eux. Inutile, à plus forte raison, de s’en faire des amis : Ils ne connaissent personne d’important au camp, ils ne mangent rien en dehors de leur ration, ne travaillent pas dans des Kommandos intéressants et n’ont aucun moyen secret de s’organiser. Enfin, on sait qu’ils sont là de passage, et que d’ici quelques semaines il ne restera d’eux qu’une poignée de cendres dans un des champs voisins, et un numéro matricule coché dans un registre. Bien qu’ils soient ballottés et confondus sans répit dans l’immense foule de leurs semblables, ils souffrent et avancent dans une solitude intérieure absolue, et c’est encore en solitaires qu’ils meurent ou disparaissent, sans laisser de trace dans la mémoire de personne. »

Il y a une page Wikipedia sur ce qu’on appelait dans les camps les « Musulmänner » :
https://fr.wikipedia.org/wiki/Muselmann

Il y a même une thèse de Paul-Bernard Nouraud (que je n’ai pas lu – On ne peut pas tout lire …) financée par la Fondation pour la mémoire de la Shoah :
http://www.fondationshoah.org/recherche/figurer-lautre-essai-sur-la-figure-du-musulman-dans-les-camps-de-concentration-nazis-paul

figuremusulman

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Fiche de lecture sur le programme Aktion T4, extermination des malades mentaux par les nazis (Livre de Michael Tregenza).

Aktion T4

* Aktion T4 : Le secret d’Etat des nazis : l’extermination des handicapés physiques et mentaux de Michael Tregenza. Livre très instructif sur l’état d’esprit des nazis à l’égard des malades mentaux.

Voici une sélection extraite de ma lecture de ce livre :

p 58 : La glorification de la santé et du travail atteignit de tels sommets que, aux yeux des nazis, « il n’y avait pas de plus grand péché qu’un manque d’ardeur au travail ». … Avec le slogan « Vous devez être en bonne santé pour le peuple et pour l’Etat ! », avec leur obsession de la jeunesse, de la santé et du travail, les nazis firent de la maladie un crime.

Etroitement liée à la recherche nazie sur le cancer, l’une des plus avancées du monde à l’époque, la campagne antitabac était intimement associée au lexique idéologico-racial des nazis. Les affiches présentaient le tabagisme comme « la détestable habitude typique des Juifs, Tsiganes, Noirs, communistes, capitalistes, ainsi que des homosexuels, prostitutées et infirmes ».

p 59 : Cependant, les questions d’hygiène raciale demeurèrent bien ancrées dans le domaine de la médicine traditionnelle, principalement entre les mains de médecins SS. Eux seuls étaient habilités à décider qui était juif, tsigane, homosexuel ou antisocial, qui souffrait d’une maladie mentale héréditaire, de schizophrénie ou d’épilepsie.

p 63 : Portrait de Christian Wirth. Wirth rejoignit la Kripo en 1919 dan la brigade chargée des viols, des vols avec coups et blessures et des cambriolages. En 1923, il était chef de la Dienststelle II, qui allait demeurer son QG jusqu’à l’automne 1939. La police lui convenait parfaitement. Les particularités propres au policier, selon la croyance populaire, coïncidaient parfaitement avec la personnalité de Wirth : autoritarisme, dogmatisme, conservatisme, méfiance, cynisme, hostilité et, dans une certaine mesure, racisme. Bref, des traits de caractère qui distinguaient quelque peu la police du reste de la société. Pendant le service, c’était un partisan de la manière forte, et dans les centres de la Kripo, les cellules de la prison ou encore le centre d’interrogatoire installé dans les hôtels Silber et Norbert, il avait une réputation d’interrogateur chevronné. Il agissait avec une brutalité froide, jamais prise en défaut. Il était impossible de discuter avec lui ; il ignorait ceux de ses subordonnés qui n’étaient pas de son avis et se méfait systématiquement de toute personne cultivée.

p 64 : Nul doute que Wirth était un fonctionnaire professionnel, quoique brutal, qui estimait effectuer un travail difficile et complexe exigeant toute une gamme de compétences et d’aptitudes, y compris la capacité d’assouplir ou d’enfreindre les règles s’il le jugeait nécessaire, dans l’intérêt de la loi et de l’ordre. Il était un adepte convaincu de l’ « autoritisme », c’est-à-dire de la légitimité de ceux qui détiennent l’autorité et le pouvoir et l’exercent aux dépens de la liberté individuelle. Dans toute police, il existe des policiers qui, cautionnés par d’excellents rapports sur leur travail, se permettent d’aller au-delà des normes, assurés que leurs transgressions seront tolérées.

p 79 : Hefelmann avait aussi puisé dans les écrits de Friedrich Nietzsche, dont les idées et la philosophie furent souvent pillées à mauvais escient par les nazis. Le philosophe était partisan d’une euthanasie volontaire, c’est-à-dire du droit de tout individu demeuré lucide, ne justifiant aucunement l’ingérence de l’Etat, de

         mourir fièrement lorsqu’il n’est plus possible de vivre fièrement. La mort choisie librement, la mort en temps voulu, avec lucidité et d’un cœur joyeux, accomplie au milieu d’enfants et de témoins, alors qu’un adieu réel est encore possible, alors que celui qui nous quitte existe encore.

         Le problème des malades mentaux incurables – les « poids morts » et les « parasites de la société » dans le jargon nazi -, que Nietzsche désignait sous le terme général de « malades », était une tout autre question pour le philosophe. Son attitude, à cet égard, correspondait exactement à celle des nazis :

         Le malade est un parasite de la société. Arrivé à un certain état, il est inconvenant de vivre plus longtemps. L’obstination à végéter lâchement, esclave des médecins et des pratiques médicales, après que l’on a perdu le sens de la vie, le droit à la vie, devrai entraîner de la part de la société un profond mépris.

Voilà un jugement aux antipodes de l’humanisme.

p 81 : Les idées et propositions de Binding et de Hoche, soigneusement argumentées quoique complexes, étaient présentées sous la forme de paragraphes numérotés comme il était d’usage pour un traité de philosophie. Les auteurs y examinaient l’acte d’euthanasie non seulement pour les malades mentaux incurables (qu’ils qualifiaient de « vie indigne d’être vécue »), mais également pour une grande partie des malades mentaux, des imbéciles et des enfants attardés ou difformes. Ils avaient fondamentalement décidé de saper la tradition du serment d’Hippocrate, affirmant que la décision d’intervenir médicalement devrait s’inspirer de considérations utilitaires : les personnes étaient « précieuses » uniquement pour leur utilité et leur contribution à la société ; leur « qualité de vie » devait donc être le facteur déterminant dans un traitement médical. Selon les catégories déterminées par Binding et Hoche, certaines personnes, y compris les enfants, menaient une « vie indigne d’être vécue » : ceux qui étaient atteints d’une maladie en phase terminale, les handicapés physiques et les malades mentaux.

p 80 : La « bible » de Hefelmann était un traité intitulé die Freigabe der Vernichtung lebensunwerten Lebes (« La libéralisation de la destruction d’une vie qui ne vaut pas d’être vécue »). Cet ouvrage déterminant avait été écrit par deux professeurs allemands de Fribourg, l’avocat Karl Binding, professeur de droit à la retraite, et Alfred Hoche, professeur de psychiatrie et de neuropathologie. Binding, l’auteur principal, avait pris sa retraite à Fribourg après une carrière sans faille de quarante ans d’enseignement dans les universités de Heidelberg, Fribourg, Strasbourg et Leipzig. Il était l’un des grands spécialistes allemands de droit constitutionnel et de droit pénal. Hoche, lui, était un personnage moins brillant. Les deux professeurs étaient tous deux d’extrême droite et leurs convictions – concernant le rejet des droits de l’individu et l’exaltation des droits de la communauté nationale – apparaissaient très nettement dans leurs écrits.

p 81 : Bien que traité ait été controversé et que sa proposition d’éliminer les vies inutiles n’ait pas bénéficié d’un grand soutien dans les milieux médicaux allemands, de nombreuses idées de cet ouvrage détaillé et complexe allaient former l’axe de la conception nazie de l’euthanasie : une euthanasie imposée par l’Etat et présenté comme une mesure nationale d’ordre économique. En particulier, Binding et Hoche fournirent aux nazis tout un vocabulaire, par exemple « vie indigne d’être vécue », « poids morts », que ces derniers reprirent ultérieurement en termes plus crus : « inutiles mangeurs de pain » et « bouches inutiles ». Une grande partie du texte de ces deux professeurs aux tendances conservatrices fut utilisé (et délibérément à mauvais escient) par les nazis pour justifier leur entreprise d’euthanasie.

p 82 : Hoffmann, critique de la culture de masse et interprète de la science, affirma catégoriquement, sous le pseudonyme d’Ernst Mann, que « la misère ne pouvait être éradiquée du monde que par l’extermination sans souffrance des miséreux ». Ceux qui étaient le plus à même de réaliser cette entreprise étaient les médecins, « les véritables sauveurs de l’humanité », selon Hoffmann.

p 83 : En Amérique du Nord, un puissant mouvement eugéniste faisait campagne pour convaincre le public que les malades mentaux étaient de « dangereux déviants sociaux », « moralement pervertis ».

p 84 : Tout compte fait, le fondement philosophique du rapport de Morell était un mélange typiquement nazi d’inhumanité, de « faits » bizarres, prétendument naturels ou historiques. L’auteur rejetait en outre toute idée de droits des victimes en tant qu’êtres humains. Ce faisant, ce médecin de la haute société ignorait tout simplement les principes du serment d’Hippocrate auxquels sont tenus tous les médecins. Ce rapport allait constituer la base d’un exposé qu’il présenta à Hitler sur l’euthanasie.

p 95 : Si ces éminents médecins purent ignorer le serment d’Hippocrate, c’est parce qu’ils fonctionnaient au sein du système nazi auquel ils étaient dévoués. Mais ce dernier était dénué de toute valeur humaine et faussé par les conceptions politiques et scientifiques de l’eugénisme à cette époque, selon lesquelles certains êtres ne présentaient pas le moindre intérêt pour la société. Le système de valeurs qui sous-tend la protection de la vie humaine et la dignité des patients – êtres vulnérables par définition – leur faisait défaut. En Allemagne, la majorité des médecins étaient membres du parti nazi ; en vertu du « principe du Führer », ils n’avaient donc de compte à rendre qu’au parti et à l’Etat. Selon eux, la médecin avait pour unique objectif de servir l’Etat.

p 314 : Bernotat, décrit comme « un petit gratte-papier qui parlait d’ « idiots » et de « vie indigne d’être vécue » « , était convaincu qu’il fallait maltraiter les patients afin « que le plus grand nombre possible veuille mourir ». Il n’avait, semble-t-il, jamais entendu parler des périodes de rémission entre deux attaques d’épilepsie ou de schizophrénie. Selon lui, tous les patients des asiles psychiatriques relevant de ses bureaux étaient « incurables » et donc candidats à l’euthanasie, idée qu’il inculqua à ses subordonnés du département de la Santé.

p 322 : L’infirmier Paul Rauter estimait que les victimes étaient véritablement « des existences indignes d’être vécues », dont bon nombre avaient déjà passé trente ou quarante ans dans des asiles, ce qui avait coûté plusieurs milliers de Reichmarks au contribuable. Il croyait que les énormes sommes englouties dans les soins de ces patients seraient alloués à la construction de logements pour les familles nombreuses ayant des enfants en bonne santé.

p 337 : Wirth était un petit tyran, un homme qui, parce qu’on lui avait conféré du pouvoir, se délectait de l’atmosphère de peur qu’il avait intentionnellement créée. Il avait besoin de se savoir précédé par la peur, une peur dont les répugnants relents persistaient après son départ.

p 340 : Bormann, probablement satisfait d’être de nouveau personnellement impliqué dans l’entreprise d’euthanasie, répondit à son vieux camarade en soulignant le caractère impératif des mesures d’euthanasie, et en ne mentionnant que les cas les plus terribles :

         J’estime inconcevable d’entretenir les malades mentaux absolument incurables qui, pour la plupart, sont incapables de s’habiller et de s’alimenter seuls et qui, du matin au soir, ont besoin de l’aide d’un ou plusieurs aides-soignants pour demeurer en vie. Il est parfaitement anormal qu’ils restent en vie alors qu’ils ne sont pas le moins du monde capables de subsister par eux-mêmes.

Mes recherches sur les protéines en 2002.

SAMI ANNEE 2001-2002

STAGE DE DESS « ANALYSE ET ETUDES STRUCTURALES
EN CHIMIE ORGANIQUE ET BIOLOGIQUE »

COMPARAISON QUANTITATIVE DE PROTEINE
PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

MAITRE DE STAGE : IVO GLYNNE GUT, PHD
HEAD OF TECHNOLOGY DEVELOPMENT
TELEPHONE : 01 60 87 83 59

CENTRE NATIONAL DE GENOTYPAGE
BATIMENT G2
2 RUE GASTON CREMIEUX
CP 5721
91057 EVRY CEDEX

Je remercie pour leur bienveillance
mon professeur J.C.TABET
et mon maître de stage I.G.GUT
qui ont changé ma vie.

Sommaire
Sommaire 1
Abbréviations utilisées : 1
Le projet protéomique au CNG 2
Problèmatique chimique 2
Conséquence pour l’intéraction antigène-anticorps 3
Problèmatique analytique : Localisation d’une modification chimique 3
Méthodes expérimentales 5
Réactifs 5
Détermination du nombre de résidus Lysine accessibles dans une protéine 12 5
Réaction chimique avec les anhydrides 5
Digestion protéolytique 5
Purification sur phase inverse des peptides protéolytiques. 6
Méthode de déposition sur cible pour MALDI-TOF 6
Spectres MALDI-TOF 6
Logiciels d’identification des peptides 7
Résultats 7
Couverture séquentielle de la BSA 7
Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA 9
Chimie des anhydrides 9
Réactivités comparées des anhydrides homologues 14
Quantification relative sur des solutions de concentration différentes 16
Discussion 19
Couverture séquentielle et identification de résidus modifiés 19
Réactivité des fonctions amine 19
Localisation d’une modification 19
Sélectivité en fonction du pH 19
Quantification relative 19
Conséquence pour l’intéraction immunospécifique. 19
Conclusion – Objectifs 20
Bibliographie 22
Annexes 24
Table des figures 45
Tables des figures en annexe 45
Index des tableaux 47
Index des tableaux en annexe 47
Abbréviations utilisées :

• MALDI-TOF : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – Time of Flight.
• MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
• HEPES : N-Hydroxyethyl Piperazine N2 Ethanesulfonic Acid.
• TFA : Acide TrifluoroAcétique
• HCCA : α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid.
• ICAT : Isotope Coded Affinity Tag.
• DTT : dithiothreitol.
• OGP : β-octyl glucopyrannoside.
• THF : tetrahydrofuranne.
• PITC : phenylisothiocyanate.
• TNBS : TrinitroBenzeneSulfonic acid.

• NM : pic du peptide non modifié.
• A1 : Acétylation d’un résidu.
• A2 : Acétylation de 2 résidus.
• A3 : Acétylation de 3 résidus.
• P1 : propionylation d’un résidu.
• P2 : propionylation de 2 résidus.
• P3 : propionylation de 3 résidus.

Le projet protéomique au CNG
Le projet dans lequel s’inscrit mon stage a pour sujet l’union de 2 principes : la quantification relative par modification chimique différentielle de protéines issues d’extraits cellulaires d’origine distincte et la séparation des protéines par intéraction immunospécifique (antigène-anticorps).
L’intégration des 2 principes constitue une nouveauté (d’ors et déjà brevetée). Cette méthode d’analyse a l’ambition de rem-placer les outils classiques de séparation et d’identification des protéines, tels que les gels bidimensionnels suivi d’une pro-téolyse intragel et après extraction, d’une analyse sur spectromètre de masse MALDI-TOF. Le problème de cette méthode est la quantification des protéines de basse expression souvent cachées par les protéines majoritaires.
Le projet étant à son commencement, il s’agit d’abord de montrer la faisabilité sur des protéines modèles pour lesquelles existent des anticorps commerciaux. Pour ce stage, seule l’albumine de serum bovin BSA est étudiée. En cas de succès de cette étape d’évaluation, la collaboration avec des laboratoires extérieurs permettra d’accéder à un très grand nombre d’anticorps et à l’intégration de ceux-ci dans des gels tridimensionnels1.
Problèmatique chimique
Le sujet du stage porte sur la faisabilité d’une modification chimique différentielle de protéines détectable par mesures des masses (avec un spectromètre MALDI-TOF) de peptides obtenus après digestion protéolytique (Figure en annexe n° 1). La modification différentielle consiste en une modification d’un résidu ou de plusieurs de la protéine par 2 réactifs homologues de même nature introduisant deux déplacements en masse différents. La modification des fonctions amine par les anhydride a été choisie pour sa simplicité et la disponibilité de 2 réactifs homologues. Les anhydrides acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da (Figure en annexe n° 2). La différence 14 Da est suffisante pour être résolue avec un spectromètre MALDI-TOF linéaire. La question est de savoir si les 2 réactifs homologues ont bien la même réactivité vis à vis d’une protéine, afin de valider la possibilité d’une quantification relative.
Il existe une chimie différentielle (ICAT pour Isotope Coded Affinity Tag 2,3), dont la quantification est basée sur une différence de 8 Da entre le réactif « léger » et le réactif « lourd » (réactif « léger » deutérié 8 fois (Figure en annexe n° 3). Une telle différence ne peut être résolue par un spectromètre MALDI-TOF linéaire de résolution moyenne à mi-hauteur 250. D’autre part, la chimie ICAT est qu’elle réagit avec les groupes thiols intervenant dans les ponts disulfure, ce qui est rédhibitoire pour sa structure tridimensionnelle, donc pour sa capture par un anticorps. De plus, la modification ICAT (C22H39N4O6S) est particulièrement encombrante.
Il est préférable d’employer une modi-fication chimique aussi peu encombrante que possible, comme par exemple les groupes acétyles.
Dans l’optique d’une moindre perturbation de la conformation de la protéine, il est nécessaire de maîtriser le nombre de résidus modifiés. La plupart des études sur le sujet proposent la modification de l’ensemble des fonctions amines primaires accessibles (au nombre de 12 en ce qui concerne la BSA : voir RESULTATS) et conduisent souvent à la perte de la confor-mation native de la protéine. Le nombre de marquages doit être suffisant pour être observables et utilisables en quantification sans modifier fondamentalement l’inté-raction antigène-anticorps. La question est de savoir si la fixation de la quantité de réactif ou la fixation du pH peuvent permettre de parvenir à cet objectif.
Une chaîne polypeptidique peut inclure un groupe α aminé, s’il n’est pas bloqué, et un nombre quelconque de fonctions ε-amine des groupes Lysines.
Tous ces groupes ont des réactivités similaires, mais les valeurs de pKa sont relativement différentes :
8 pour les fonctions α-amino et 10 pour les fonctions ε-amino.
Les fonctions amine sont majoritairement protonées à un pH inférieur à 6, mais seule la forme déprotonée est chimiquement réactive :

Si le pH est fixé à une valeur pour lequel la fonction α-amino est plus déprotonées que les fonctions ε-amino, il est envisageable de modifier sélectivement la fonction α-amino du résidu N-terminal. Ce serait une voie intéressante pour préserver la structure tridimensionnelle, puisqu’un seul résidu serait modifié. Toutefois, il est probable que la prépondérance numérique des groupes ε-amino accessibles (12 dans le cas de la BSA) anihile la réactivité supérieure du groupe α-amino.
La question est de savoir si la chimie des anhydrides modifie seulement la fonction amine N-terminal ou bien si elle modifie également les résidus Lysine. Les résidus Arginine contiennent une fonction guanidine nucléophile (Figure en annexe n° 5). Les variations du pH de réaction montrera dans quelle mesure la modification de ces résidus peut être limitée.
Conséquence pour l’intéraction antigène-anticorps
La question est de savoir si la modification chimique des fonctions amine peut altérer la liaison protéine-anticorps.
En effet, la structrure tridimensionnelle est maintenue d’une part grâce aux liaisons disulfure et d’autre part grâce aux liaisons électrostatiques auxquelles peuvent participer les fonctions amine. La modification chimique des fonctions amine pourraient bien en conséquence altérer la conformation de la protéine et donc sa capture par un anticorps.
Un moyen de connaître l’altération de la conformation de la protéine modifiée est une expérience de dichroïsme circulaire.
Le recouvrement ou le non-recouvrement des épitopes de la protéine avec un anticorps particulier s’ils sont contigus et connus et des résidus Lysine ou Arginine modifiés, peut permettre en première approximation d’estimer le risque de voir l’intéraction immunospécifique perturbée.
Une cartographie des épitopes4 de BSA a été réalisée dans le cas de 2 anticorps « AB3 » et « AB6 » produits par le laboratoire à l’origine de l’étude. Pour l’anticorps AB3, l’épitope réside dans le résidu Met-546 et les acides aminés proches (épitope contigu). Pour l’anticorps AB6, l’épitope, également de forme contigue, réside dans le peptide [299-338].
L’objectif du projet n’est pas de déterminer des épitopes d’une protéine donnée, mais de vérifier que la spécificité d’un anticorps avec sa protéine n’est pas altérée par une modification chimique. Ceci est possible grâce à la mesure des constantes d’association entre une protéine et son anticorps sur l’instrument BIACORE (technologie Surface Plasmon Resonance).
Pour l’instant, nous formons l’espoir que la modification de quelques résidus ne modifient pas fondamentalement l’intéraction protéine-anticorps.
Problèmatique analytique : Localisation d’une modification chimique
La localisation d’une modification chimique dépend d’une bonne couverture de la séquence protéïque : en effet, si une endoprotéinase telle que la trypsine (Figure en annexe n° 7) produit des peptides recouvrant au mieux 40 % de la séquence, il n’en reste pas moins que la plupart de ceux-ci ne contiennent pas les acides aminés modifiés (dans le cas de la chimie des anhydrides).
D’où l’idée de recourir à plusieurs endoprotéinases complémentaires (
Figure en annexe n° 6) afin d’obtenir une bonne couverture séquentielle pour repérer les acides aminés modifiés.
A cela s’ajoute une contrainte supplémentaire : pour être observable en spectrométrie de masse MALDI-TOF, il est souhaitable qu’un peptide protéolytique ait une masse supérieure à 1300 Da. En effet, la région 200-1300 Da (parfois même jusque 1600 Da) comporte de nombreux pics d’agrégats matriciels5 (HCCA) et ces pics ne peuvent pas toujours être distingués des pics de peptides. Plusieurs facteurs influencent leur formation : présence de cations, rapport analyte/matrice (qui peut être très variable). Ces pics d’agrégats ne pouvant être éliminés systématiquement, seules les masses supérieures à 1300 Da seront employées.
Le choix de l’endoprotéinase permet de palier cette contrainte : moins une enzyme produit de coupures, plus les peptides sont longs et plus leur masse est grande (
Figure en annexe n° 6 et Tableau en annexe n° 1). Le nombre de coupures d’une enzyme est proportionnelle à la fréquence dans les protéines des acides aminés dont elle est spécifique (Tableau en annexe n° 2). Cette spécificité dépend pour certaines endoprotéinases du tampon, ce qui nous laisse un paramètre supplémentaire pour maîtriser la longueur des peptides produits : l’endoprotéinase Glu C6 produit des coupures après les résidus d’acide glutamique (E) dans le tampon bicarbonate d’ammonium et après les résidus d’acide glutamique (E) et d’acide aspartique (D) dans le tampon Phosphate. La longueur d’un peptide protéolytique dépend aussi du nombre de coupures oubliées par la protéase. L’endoprotéïnase Glu C oublient très peu de coupures, tandis que la trypsine, elle, en oublie fréquemment une ou deux (Voir RESULTATS). Les courtes durées de digestion et les faibles rapports (Voir RESULTATS) enzyme/protéine favorisent un grand nombre de coupures oubliées.
Notons que l’acétylation d’un résidu Arginine R (ou Lysine K) rendrait caduque une coupure spécifique d’une liaison R/X (ou K/X) par l’endoprotéinase Arg C (ou la trypsine), d’où l’intérêt pour l’endoprotéïnase Glu C.
L’obtention d’une bonne couverture de la séquence est donc essentielle. Cet impératif analytique n’est pas nouveau : il correspond aux objectifs classiques de la protéomique : l’identification de protéines dans les mélanges complexes.
En plus des facteurs déjà évoqués (variété, complémentarité, spécificité des endopro-téinases, durée de digestion et rapport enzyme/protéine), le recouvrement d’un maximum de peptides dépend aussi de la préparation des échantillons pour MALDI-TOF (purification par phase inverse pour l’élimination des réactifs et ions indésirables pour l’ionisation MALDI, méthode de déposition).
L’emploi de conditions stringentes dans la protéolyse ou de détergent sont souvent évoqués pour augmenter la couverture séquentielle de protéines particulières. L’emploi de DTT7 pour la réduction des ponts disulfure (et) d’iodoacétamide8,9 pour l’alkylation, de l’urée agissant comme chaotrope a été explorée sans avoir été systématiquement étudiée. L’emploi du détergent non ionique OGP10 (β-octyl glucopyrannoside), conseillé dans les opérations d’évaporation sous-vide (Speedvac) et en spéctrométrie de masse, a également été essayé. Il n’est pas apparu que l’emploi de DTT et d’iodoacétamide ou encore de l’OGP augmente la couverture séquentielle de la BSA. Le plus souvent les échantillons ont été dénaturés thermiquement à 90°C pendant 5-10 min11. De telles conditions stringentes ont été employées dans un but analytique : observer le plus possible de peptides modifiés. Une trop grande stringence pourrait être préjudiciable à la conservation d’un complexe anticorps-protéine. Des essais ont montré que la même couverture (en ce qui concerne BSA) a été obtenue sans dénaturation.
Méthodes expérimentales
Réactifs
La protéine BSA (Albumine de Serum Bovin ; Sigma A0271), les endoprotéinases Glu C (de source chaîne V8 de Staphyloccocus aureus ; Sigma P2922) et Arg C (glandes submaxillariennes de souris ; Fluka 45173) ont été fournis par SIGMA, la trypsine « sequencing grade » par PROMEGA.
Les anhydride acétique et propionique, les solvants THF, acétonitrile, propan-2-ol, méthanol, les tampons MES, HEPES, hydrogénophosphate de sodium, la matrice HCCA (acide alpha-cyano hydroxy-cinnamique) ont été fournis par ALDRICH. Le gel SEPHADEX G25 Fine provient de AMERSHAM BIOSCIENCES.
La résine échangeuse d’ion utilisée a été fournie par BIO RAD : il s’agit d’une résine AG 50W-X8 (100-200 mesh) sous forme d’ions Hydronium.
Détermination du nombre de résidus Lysine accessibles dans une protéine 12
Les résidus Lysine sont modifiés par le réactif TNBS (acide TrinitroBenzene-Sulfonic) en large excès dans un tampon tétraborate de sodium Na2B4O7 (0,1 M) dans la soude NaOH (0,1 M) (pH = 8). Pour 50 µL de protéine, utiliser 50 µL de tampon et 10 µL de réactif TNBS. Après 5 minutes, la réaction est arrêtée par addition de 200 µL de tampon dihydro-génophosphate de sodium NaH2PO4 (pH = 7) contenant du sulfite de sodium Na2SO3 (1,5 mM). Après dilution d’un tiers, l’absorbance à 420 nm (Voir RESULTATS est mesurée (Blanc : Même solution sans protéine).
Les groupes trinitrophenyl-amine forment un complexe avec l’ion sulfite. A 420 nm, le coefficient d’extinction molaire de ces groupes vaut 19 200 M-1.cm-1 (selon la référence 12).
Le nombre de résidus Lysine accessibles peut être calculé en fonction de la concentration initiale en protéine à partir de loi de Beer-Lambert.
avec : nombre de résidus Lysine accessibles ; ε : coefficient d’extinction molaire (19 200 M-1.cm-1) ; f : facteur de dilution (ici ).
Réaction chimique avec les anhydrides
La solution de protéine BSA (classée instable) est préparée chaque jour. Sa concentration est fixée à 100 pmol/µL et la réaction est effectuée sur 20 µL (2000 pmol). Les 2 anhydrides homologues sont dissous à la même concentration (42 pmol/µL) dans le solvant THF. Un aliquot (1 µL) ou plusieurs de ces 2 réactifs est ajouté à 2 échantillons contenant la même protéine à des concentrations diverses. La réaction est effectuée à température ambiante pendant une heure dans un tampon MES (pH=5.0 ; concentration finale = 0,1 mol/L). Le doublement de la concentration du tampon n’a pas d’influence sur l’avancement de la réaction. Aucune évolution de l’avancement de la réaction n’a été observée après une heure. Le mélange réactionnel est ensuite purifiée par filtration sur gel SEPHADEX G25 fine (400 µL). Le filtrat est ensuite stocké à – 20°C.
Digestion protéolytique
Chaque échantillon est dénaturé thermiquement à 90°C pendant 5-10 min avant digestion.
La digestion par la trypsine est effectuée dans un tampon bicarbonate d’ammonium (pH=8 ; concentration finale = 50 mM). La digestion par l’endoprotéinase Glu C se fait dans un tampon HEPES (pH=6 ; concentration finale = 50 mM) dans lequel les coupures sont attendues après l’acide glutamique (E) et l’acide aspartique (D). Le rapport enzyme/protéine est choisi égal à 1/40e (w/w).
La durée de digestion varie de 1 h à quelques heures pour l’endoprotéïnase Glu C et de 16 h pour la trypsine et l’endoprotéinase Arg C.
La température de digestion est de 37°C. Celle-ci doit être soigneusement notée, car le profil de digestion en dépend (observation faite avec l’endoprotéïnase Glu C).
Purification sur phase inverse des peptides protéolytiques.
Afin de retirer les divers contaminants rédhibitoires pour l’ionisation MALDI, les cônes ZIPTIP chargés en phase stationnaire C18 de la société MILLIPORE ont été utilisés. Les cônes ZIPTIP sont d’abord conditionnés avec l’acétonitrile (pour la rétention par partage hydrophobe) et avec l’acide trifluoroacétique TFA 0,1 % (pour la rétention par échange d’ion dynamique). Les échantillons sont acidifiés avec TFA 2% avant d’être retenus sur la phase stationnaire. Le lavage est fait à l’aide de TFA 0,1 %. Afin de recueillir le maximum de peptides, l’élution est réalisée dans un système binaire acétonitrile/eau avec 3 compositions différentes (10/90, 50/50, 90/10). Les 3 fractions sont ensuite regroupées pour être déposées sur la cible. L’analyte est donc dissous dans un système de solvant de composition finale 50/50.

La présence d’ions sodium Na+ (masse chimique = 22,98 Da), potassium K+ (masse chimique = 39,10 Da) conduit à la formation d’adduits cationiques avec un déplacement en masse de 22 Da pour le premier et de 38 Da pour le deuxième. De plus la formation d’un adduit avec un déplacement en masse de 56 Da souvent observé, correspondant à la formation de ce dernier adduit concordant avec le dépla-cement en masse produit par la propio-nylation.
Chacune des solutions utilisées dans la purification sur ZIPTIP (Acétonitrile, TFA) doivent donc être traitées par une résine échangeuse d’ion chargée en ions H+ afin d’éliminer la présence d’ion sodium Na+ et potassium K+.
Remarque : le traitement avec la résine échangeuse d’ions BIORAD d’un échantillon contenant des peptides conduit à la perte des peptides (probablement par absorption sur la résine).
Méthode de déposition sur cible pour MALDI-TOF
La méthode de déposition sur cible10,13-17 est la « méthode des 2 couches ». C’est une méthode hybride de la « méthode à évaporation rapide »18 et de la « méthode de la goutte séchée ». La « méthode à évaporation rapide » consiste en un dépôt d’une première couche de matrice et d’une deuxième couche d’analyte. La méthode de la goutte séchée consiste en un dépôt d’une seule couche d’un mélange matrice/analyte.
Dans la méthode utilisée dans ce travail, la première couche est constituée uniquement de matrice (HCCA, matrice acide, à 5 mg/ml dans un mélange de solvant acétone/méthanol (80/20 v/v) et la deuxième couche est un mélange de matrice et d’analyte (HCCA 5 mg/ml dans un mélange de solvant isopropanol/TFA 2% (50/50 v/v)). Le rapport analyte/matrice (v/v) généralement employé est égal à 4/1. Afin d’éviter la redissolution complète de la première couche d’HCCA (matrice hydrophobe) par l’acétonitrile contenu dans la solution d’analyte, celle-ci est préalablement appauvrie en acétonitrile par évaporation sous vide (Speedvac).
Spectres MALDI-TOF
Les spectres MS ont été enregistrés avec
un MALDI-TOF linéaire de marque BRUKER (modèle BIFLEX III) de résolution moyenne à mi-hauteur 250. Les échantillons ont été déposés sur une cible en Aluminium-Ni avec 386 positions. L’acquisition est réalisée de façon automatique. En général, 150-200 tirs ont été moyennés pour produire un spectre de masse. Chaque spectre a été normalisé en utilisant le signal le plus intense. Les ions ont été produits en mode positif avec une tension d’accéleration Uis1 = 20 kV et un délai d’extraction de 300 ns.
Logiciels d’identification des peptides
Les 2 logiciels utilisés pour l’identification des peptides à partir des masses expérimentales sont FINDPEPT de l’organisation SWISSPROT (serveur http://www.expasy.com) et ProteinProspector-MS FIT de l’université de San Francisco (serveur http://prospector.ucsf.edu/). Les 2 logiciels permettent d’identifier les peptides qui résultent de coupures spécifiques et non spécifiques et tient compte des modifications post-translationnelles. Le premier logiciel a l’avantage sur le deuxième de pouvoir identifier les modifications chimiques définies par l’utilisateur (acétylation : ajout de C2H2O ; propionylation : ajout de C3H4O).
Résultats
Couverture séquentielle de la BSA
La trypsine produit 9 peptides recouvrant 26 % de la séquence de la BSA (Figure en annexe n° 7 et Document 1 en annexe).
L’endoprotéïnase Glu C produit 5 peptides (Tableau 1 et Figure 5) recouvrant 20 % de la séquence (rapport enzyme/protéine = 1/40e w/w).

Peptide masse du
peptide Coupure
oubliée
155-164 1361,4 Da 0
165-176 1518,8 Da 0
191-206 1720,9 Da 1
232-250 2186,0 Da 0
424-448 2878,2 Da 0
Tableau 1 : peptides produits par l’endoprotéïnase Glu C
(1/40e w/w).
Dans le cas de rapport enzyme/protéine plus faible (1/400e w/w), l’endoprotéïnase Glu C produits deux nouveaux peptides sont recouverts, qui ont respectivement 1 et 3 coupures oubliées (Tableau 2). La couverture séquentielle avec l’endoprotéïnase Glu C passe alors de 20% à 23,5 %.

Peptide masse du
peptide Coupures
oubliées
304-319 1837,5 Da 3
(Figure en annexe n° 9)
232-253 2560,8 Da 1
(Figure en annexe n° 10)
Tableau 2 : peptides supplémentaires
produits par l’endoprotéïnase Glu C
(1/400e w/w).
L’endoprotéïnase Arg C produit 4 peptides (Figure en annexe n° 8) dont 2 ne correspondent pas à des coupures spécifiques. De ce fait, leur attribuer une séquence univoque sur la seule donnée de leur masse moléculaire est impossible. En effet il correspond 10 séquences possibles au peptide de masse 2016,0 Da et 3 séquences possibles au peptide de masse 2521,6 Da (Tableau en annexe n° 3).
La Figure 1 montre la superposition des couvertures séquentielles obtenues par les 3 endoprotéinases. La couverture totale est égale à 31 %.

Endoprotéinase
(T : Trypsine ;
G : Glu C ;
A : Arg C )
Peptide Masse Coupures
oubliées Séquence
Recouvrement
des couvertures
T 66-75 1163.3 Da 0 LVNELTEFAK

G 155-164 1361.4 Da 0 KKFWGKYLYE
T 156-167 1574.8 Da 2 KFWGKYLYEIAR

T 161-167 927.4 Da 0 YLYEIAR

G 165-176 1518.8 Da 0 IARRHPYFYAPE
T 168-183 2044.2 Da 1 RHPYFYAPELLYYANK

G 191-206 1720.9 Da 1 CCQAEDKGACLLPKIE
A 223-232 1137.2 Da 0 CASIQKFGER
G 232-250 2186 Da 0 RALKAWSVARLSQKFPKAE
G 232-253 2560.8 Da 1 RALKAWSVARLSQKFPKAEFVE
G 304-319 1837.5 Da 3 KPLLEKSHCIAEVEKD
G 318-337 2198.7 Da 0 KDAIPENLPPLTADFAEDKD
T 341-359 2299.8 Da 1 NYQEAKDAFLGSFLYEYSR

T 347-359 1567.3 Da 0 DAFLGSFLYEYSR

T 421-433 1479.3 Da 0 LGEYGFQNALIVR

G 424-448 2878.2 Da 0 YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE
A 437-451 1637.9 Da 0 KVPQVSTPTLVEVSR
T 508-523 1823.1 Da 0 RPCFSALTPDETYVPK

T 549-561 1486.6 Da 1 QTALVELLKHKPK
Figure 1 : couverture séquentielle de la BSA
(digestion par la trypsine, l’endoprotéïnase Glu C et l’endoprotéinase Arg C ).

Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA
L’absorbance à 420 nm a été mesurée (Figure 2) et le nombre de résidus Lysine accessibles dans la BSA calculé (Figure 3) pour 5 solutions de protéine BSA modifiée par TNBS de concentration initiale 20-40-60-80-100 pmol/µL.

Figure 2 : Absorbance à 420 nm du complexe trinitrophenyl-amine-ion sulfite.

Figure 3 : Nombre de résidus Lysine accessibles
dans la protéine BSA
Chimie des anhydrides
Dans la suite, les notations suivantes seront adoptées :
• NM : pic du peptide non modifié.
• A1 : Acétylation d’un résidu.
• A2 : Acétylation de 2 résidus.
• A3 : Acétylation de 3 résidus.
• P1 : propionylation d’un résidu.
• P2 : propionylation de 2 résidus.
• P3 : propionylation de 3 résidus.
Identification des peptides modifiés
Pour repérer les déplacements en masse + 42 Da et + 56 Da sans équivoque, (en l’absence de spectromètre de masse MS/MS), la protéine acétylée et la protéine propionylée sont digérées séparément. Ces deux contrôles sont comparés à la digestion du mélange des deux (Figure 4).

Figure 4 : Acétylation et propionylation
d’une même quantité de protéine
(tampon MES pH=5 ;
anhydride/protéine = 0,06).
Modification localisée sur le peptide
de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence
YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux.

La formation d’adduit cationique + 56 Da est illustrée ici par la présence d’un peptide de masse 2990,9 Da dont l’attribution est équivoque sans spectre MS/MS, puisqu’il correspond soit à la modification de 2 résidus du peptide de masse 2878,2 Da soit à la formation d’un adduit cationique +56 Da du peptide contenant un résidu modifié.

L’intensité du pic de rapport m/z = 2934 pourrait être soit diminuée par l’apparition d’adduit +56 Da du peptide de masse 2934 Da, soit augmentée par l’apparition d’adduit cationique + 56 Da du peptide de masse 2878,2 Da.

L’influence de la formation d’adduit cationique + 56 Da sur la quantification doit donc être étudiée (Voir « QUANTIFICATION RELATIVE SUR DES SOLUTIONS DE CONCENTRATION DIFFERENTES »).
Identification des résidus modifiés
La digestion par la trypsine de la BSA produit 9 peptides de masse supérieure à 900 Da dont 2 sont modifiés par la chimie des anhydrides (Figure en annexe n° 7). Pour le premier (Figure en annexe n° 11), 2 séquences sont possibles (Tableau 3). Pour la première séquence, le résidu modifié peut être identifié : il ne peut s’agir que du résidu K-100, car la modification du résidu R-105 rendrait caduque la coupure de la liaison R-105/E-106. Pour la deuxième séquence, il est peu probable que le résidu K-183 soit modifié, car il se trouve du côté C-terminal du peptide et cela correspondrait à une coupure non spécifique de la trypsine.

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
89-105 1 K-100
(R-105
à exclure)
Séquence :(K)/SLHTLFGDELCKVASLR/(E)
1889,0 Da(1 coupure oubliée)
169-183 0 K-183
Séquence : (R) HPYFYAPELLYYANK (Y)
1888.9 Da (0 coupures oubliées)
Tableau 3 : les 2 séquences possibles pour le peptide
de masse 1888,5 Da.
Pour le deuxième (Figure en annexe n° 12), le peptide non modifié n’est pas observé. Sa masse ne peut être déduite que par soustraction de 42 Da de la masse du peptide acetylé (2341,8 Da) ou de 56 Da de la masse du peptide propionylé (2356,8 Da) et donc les 2 séquences sont possibles (Tableau 4).

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
402-420 1 K-412
Séquence :(K)/HLVDEPQNLIKQNCDQFEK/(L)
2299.5 Da (1 coupure oubliée)
341-359 1 K-346
Séquence :(K)/NYQEAKDAFLGSFLYEYSR/(R)
2302.5 Da (1 coupure oubliée)
Tableau 4 : les 2 séquences possibles pour le peptide
de masse 2300 Da.
Dans ces 2 séquences possibles, les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Lysine.
La digestion par l’endoprotéinase Arg C produit 4 peptides (Figure en annexe n° 8) dont 3 sont modifiés par la chimie des anhydrides. Pour deux d’entre eux, la séquence n’est pas connue (Figure en annexe n° 13 et Figure en annexe n° 14) et pour le troisième (Figure en annexe n° 15), la séquence est connue et le résidu modifié peut ainsi être identifié : il ne peut s’agir que du résidu K-437, car la modification du résidu R-451 rendrait caduque la coupure de la liaison R-451/S-452 (Tableau 5).

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
437-451 1 K-437
(R-451
à exclure)
Séquence :(R)/KVPQVSTPTLVEVSR/(S)

Tableau 5 : le résidu modifié de séquence identifiable observé par digestion avec l’endoprotéïnase Arg C.
Les 5-8 peptides (selon les conditions expérimentales) produits par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C (et observés dans l’intervalle 900-3500 Da) sont modifiés par la chimie des anhydrides (Tableau 6 et Figure 5 plus loin).
Ces modifications touchent les peptides produits majoritairement par l’enzyme. C’est pourquoi la possibilité d’une quantification a été étudiée principalement avec cette endoprotéïnase.

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
155-164 1 K-155
K-157
K-161
165-176 2 R-167
R-168
191-206 2 K-197
K-204
304-319 2 K 304
K 309
K 318
232-250 2-3 R-232
R 241
K 235
K 245
K 248
424-448 1 R 433
R 436
K 437
Tableau 6 : les 10-11 résidus potentiellement modifiés dans le tampon MES observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C.
Dans les peptides [155-164] et [304-319], les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Lysines.
Dans le peptide [165-176], les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Arginine.
Le peptide [424-448] contient un résidu Lysine et 2 résidus Arginine. La modification exclusive du résidu K-437 est observée avec l’endoprotéinase Arg C. Les résidus Arginine ne sont donc pas modifiés.
Le peptide [232-250] contient 2 résidus Arginine et 3 résidus Lysine. Sur les 3 résidus modifiés, 2 possibilités s’offrent : il y a soit 3 résidus Lysine modifiés, soit 2 résidus Arginine et 1 résidu Lysine modifiés. Il se peut que ce soit les 3 résidus Lysine. Pour le confirmer, une expérience MS/MS est nécessaire.
Le Tableau 7 (plus loin) regroupe l’ensemble des modifications observées sous toutes conditions avec l’endoprotéïnase Glu C.

Figure 5 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Conditions de réaction : tampon MES : pH = 5 ; anhydride/protéine = 0,08 .
Conditions de digestion : enzyme/protéine = 1/40e w/w ; durée = 5h.

Séquence du peptide
non modifié
selon le logiciel FINDPEPT
Résidus
modifiés Peptide masse du
peptide
non modifié masse du
peptide
modifié déplacement
en masse modification
(E)/KKFWGKYLYE/(I) K-155
K-157
K-161 155-164 1361,4 Da → 1400,9 + 39,5 A1
→ 1440,9 + 79,5 A2
→ 1487,5 + 126,1 A3
→ 1417,8 + 56,4 P1
→ 1472,6 + 111,2 P2
? ? P3
(E)/IARRHPYFYAPE/(L) R-167
R-168 165-176 1518,8 Da → 1560,7 + 41,9 A1
→ 1574,8 + 56,0 P1
→ 1604,4 + 85,6 P2
→ 1632,9 + 114,1 P3
(E)/CCQAEDKGACLLPKIE/(T) K-197
K-204 191-206 1720,9 Da → 1763,8 + 42,9 A1
→ 1806 + 85,1 A2
→ 1778,7 + 57,8 P1
→ 1834,8 + 113,9 P2
(D)/KPLLEKSHCIAEVEKD/(A)
K 304
K 309
K 318 304-319 1837,5 Da → 1878,5 + 41,0 A1
→ 1891,1 + 53,6 A2
→ 1919,2 + 81,7 P1
→ 1947,6 + 110,1 P2
(E)/RALKAWSVAR
LSQKFPKAE/(F) R-232
K 235
K 245
K 248
R 241 232-250 2186,0 Da → 2228,4 + 42,4 A1
→ 2270,2 + 84,2 A2
→ 2311,8 + 125,8 A3
→ 2241 + 55,0 P1
→ 2297,9 + 111,9 P2
→ 2355,3 + 169,3 P3
(E)/KDAIPENLPP
LTADFAEDKD/ (V) K 318
K 336 318-337 2198,7 Da → 2241,2 + 42,5 A1
→ 2284 + 85,3 A2
→ 2254,9 + 56,2 P1
→ 2311,8 + 113,1 P2
(E)/RALKAWSVAR
LSQKFPKAEFVE/(V) R-232
K 235
K 245
K 248
R 241 232-253 2560,8 Da → 2601,7 + 40,9 A1
→ 2644,6 + 83,8 A2
→ 2591,1 + 30,3 A3
→ 2616,5 + 55,7 P1
→ 2672,8 + 112,0 P2
→ 2729,7 + 168,9 P3
(E)/YGFQNALIVRYT
RKVPQVSTPTLVE/(V) R 433
R 436
K 437 424-448 2878,2 Da → 2919,8 + 41,6 A1
→ 2964,1 + 85,9 A2
→ 3005,5 + 127,3 A3
→ 2935,5 + 57,3 P1
→ 2992,5 + 114,3 P2
→ 3049,9 + 171,7 P3
Tableau 7 : Modifications observées sous toutes conditions de réaction et de digestion
avec l’endoprotéïnase Glu C.

Influence du pH sur la réaction
L’influence du pH a été étudiée en comparant le tampon MES (pH = 5) aux tampons monohydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 (pH = 8) et acide acétique/acétate de sodium AcOH/AcO- (pH = 4,5).
Une augmentation du pH déprotonent les fonctions amine primaire et les fonctions guanidine et les rendent plus nucléophiles :
dans le tampon NaH2PO4 (Tableau 8 et Figure en annexe n° 16, Figure en annexe n° 17, Figure en annexe n° 18)

Nombre de résidus modifiés
Peptide tampon
MES tampon
NaH2PO4 Résidus
potentiellement
modifiés
155-164 1 3 K-155
K-157
K-161
232-250 2-3 3 R-232
K 235
K 245
K 248
R 241
424-448 1 3 R 433
R 436
K 437
Tableau 8 : les résidus modifiés et observés dans le tampon monohydrogénophosphate observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C.
la conversion des fonctions amine en amide est plus grande (2 résidus Lysine supplémentaires sur le peptide [155-164] sont modifiés) et le nombre de résidus Arginine modifiés augmente (2 résidus Arginine supplémentaires sur le peptide [424-448] sont modifiés).
Dans les peptides [232-250], la conversion des 3 résidus modifiés est plus grande, sans qu’il y ait plus de résidus modifiés. Dans l’expérience décrite ici, tous les peptides n’ont pas été observés pour une raison liée probablement aux conditions de digestion et non aux conditions de réaction.

Inversement, une diminution du pH rend les fonctions amine primaire moins nucléophiles et l’avancement de la réaction est moins grand dans le tampon AcOH/AcO- que dans le tampon MES (Figure en annexe n° 19, Figure en annexe n° 20, Figure en annexe n° 21).

Remarquons que si la concentration en anhydride propionique augmente, on observe une augmentation du pic d’acétylation (Figure en annexe n° 22 en annexe) !
Le contrôle contenant la protéine, le tampon acétate de sodium/acide acétique et l’anhydride propionique montre une acétylation en plus de la propionylation (Figure en annexe n° 22).

Ce qui veut dire que l’acétate de sodium réagit avec l’anhydride propionique pour donner un anhydride mixte (acétopropionique) qui réagit ensuite en acétylant et non en propionylant la protéine (Figure en annexe n° 24).

La question est de savoir lequel des peptides modifiés permet d’obtenir la meilleure quantification relative.
Réactivités comparées des anhydrides homologues
Il est avant tout nécessaire de préciser dans quelle gamme de concentration le réactif anhydride doit être employer en mesurant son influence sur l’avancement de la réaction.
La réaction d’acétylation a été menée sur la même quantité de protéine en faisant varier la quantité d’anhydride (2, 3 et 4 µL).
Le tableau suivant donne le ratio molaire anhydride/protéine, ainsi que le ratio molaire anhydride/Lysine :

µL 2 3 4
0.04 0.06 0.08
0.42 0.63 0.85

3 peptides modifiés ont été pris en exemple : les peptides de masse 2878,2 Da (Figure en annexe n° 25), 1720,9 Da (Figure en annexe n° 26) et 1361,8 Da (Figure en annexe n° 27).
Deux rapports ont été calculés :
(rapport de l’intensité du pic du peptide acétylé sur l’intensité du pic du peptide non modifié) et (rapport de l’intensité du pic du peptide acétylé sur la somme des intensités des pics des peptides acétylé et non modifié) (Tableau 9 et Tableau 10).
La conversion du peptide [424-448] (2878,2 Da) suit une croissance monotone (sinon linéaire) avec l’augmentation de la concentration en anhydride. Par contre, la conversion des peptides [155-164] (1361,4 Da) et [191-206] (1720,9 Da) ne suit pas de croissance monotone.

En premier figure le rapport m/z du peptide non modifié (nm).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide acetylé (a).
m/z = 1361-1401 m/z = 1722-1764 m/z = 2878-2920

4 µL 0.68 0.99 3.09
3 µL 0.43 1.55 2.69
2 µL 0.86 0.83 1.45

Tableau 9 : Progression de la réaction d’acétylation
en fonction de la quantité d’anhydride
(mesuré par le rapport ).
En premier figure le rapport m/z du peptide non modifié (nm).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide acetylé (a).
m/z = 1361-1401 m/z = 1722-1764 m/z = 2878-2920

4 µL 0.41 0.50 0.76
3 µL 0.61 0.61 0.73
2 µL 0.45 0.45 0.59
Tableau 10 : Progression de la réaction d’acétylation
en fonction de la quantité d’anhydride
(mesuré par le rapport ).
Les 2 réactifs homologues ont la même réactivité vis à vis d’une protéine, si l’intensité du pic du peptide propionylé et l’intensité du pic du peptide acétylé sont les mêmes ou de qui revient au même si le rapport des deux est égale à 1 (Figure en annexe n° 28, Figure en annexe n° 29, Figure en annexe n° 30 et Tableau 11). Ceci n’est observé que sur le peptide [424-448] de plus grande masse (2878,2 Da) pour une quantité de réactif au moins supérieure à 0,06 fois celle de la protéine.
La question est maintenant de savoir si la quantification sur des solutions de concentration différente est possible.

En premier figure le rapport m/z du peptide acétylé (a).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide propionylé(p).
peptide [155-164]
m/z = 1361-1401 peptide [191-206]
m/z = 1764-1777 peptide [424-448]
m/z = 2920-2935

4 µL 0.68 0.83 0.97
3 µL 0.43 0.85 0.99
2 µL 0.86 0.73 1.12
Tableau 11 : Réactivités comparées des 2 réactifs homologues
en fonction de la quantité d’anhydride.
Quantification relative sur des solutions de concentration différentes
La concentration de l’une des solutions de protéine a été fixée à 50 pmol/µL. Cette solution est prise pour réfé-rence. L’autre solution dont la concentration doit être déterminée a été obtenue par dilution de la précédente. Les concentrations préparées sont 10-20-30-40 pmol/µL. La quantité d’anhydride a été ajustée à la concentration de protéine
(1 aliquot pour 10 pmol/µL de protéine ; le rapport anhydride/protéine est constant et égal à 0,08).
Soit la solution référence a été propionylée, et la solution de concentration variable a alors été acétylée (Figure 7). Soit la solution référence a été acetylée, et la solution de concentration variable a alors été propionylée (Figure 8). Les 2 essais ont été soumis à 5 répétitions indépendantes et les mesures ont été éffectuées sur 2 spectromètres MALDI-TOF différents.
Dans le cas où la référence a été propionylée, le rapport expérimental (Tableau 12) sous-estime le rapport des concentrations des solutions formulées lorsqu’il est inférieur à 0,20 et il surestime ce rapport lorsqu’il est supérieur à 0,60.
Dans le cas où la référence a été propionylée, le rapport expérimental (Tableau 13) diffère de moins de 20 % du rapport des concentrations des solutions formulées.
Les résultats sont regroupés sur la Figure 6 :

Figure 6 : Rapports expérimentaux des intensités du pic correspondant
à la concentration variable sur le pic correspondant à la référence
en fonction du rapport formulé.

Figure 7 : Propionylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence).
Acétylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08).
(tampon MES pH=5).
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. concentration de protéine acétylée = 10 pmol/µL.
2. concentration de protéine acétylée = 20 pmol/µL.
3. concentration de protéine acétylée = 30 pmol/µL.
4. concentration de protéine acétylée = 40 pmol/µL.
5. concentration de protéine acétylée = 50 pmol/µL. Figure 8 : Acétylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence).
Propionylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08).
(tampon MES pH=5).
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. concentration de protéine propionylée = 10 pmol/µL.
2. concentration de protéine propionylée = 20 pmol/µL.
3. concentration de protéine propionylée = 30 pmol/µL.
4. concentration de protéine propionylée = 40 pmol/µL.
5. concentration de protéine propionylée = 50 pmol/µL.

Acetylation Propionylation
(Référence)
Expérimental
(spectromètre
1) Répétitions
Expérimental
(spectromètre
2) Répétitions
Formulé
Variance
intraclasse
= 0.08 14 degrés
de liberté Variance
intraclasse
= 0.06 17 degrés
de liberté
10 50 0.14±0.07 5 0.13±0.06 5 0.20
20 50 0.31±0.12 2 0.33±0.06 5 0.40
30 50 0.64±0.08 4 0.69±0.06 4 0.60
40 50 0.9±0.08 4 0.93±0.06 4 0.80
Tableau 12 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à l’acétylation
sur l’intensité du pic correspondant à la propionylation
en fonction du rapport des concentrations formulées.
(l’encadrement de la moyenne est calculé par un Student
à 14 et 17 degrés de liberté et avec une probabilité de 95 %).

Acetylation
(Référence) Propionylation
Expérimental
(spectromètre
1) Répétitions
Expérimental
(spectromètre
2) Répétitions
Formulé
(Variance
intraclasse
= 0.06) (8 degrés
de liberté) (Variance
intraclasse
= 0.07) (13 degrés
de liberté)
50 10 0.21±0.10 2 0.16±0.07 5 0.20
50 20 0.38±0.06 5 0.39±0.07 5 0.40
50 30 0.49±0.14 1 0.56±0.08 3 0.60
50 40 0.77±0.07 4 0.79±0.07 4 0.80
Tableau 13 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à la propionylation
sur l’intensité du pic correspondant à l’acétylation
en fonction du rapport des concentrations formulées.
(l’encadrement de la moyenne est calculé par un Student
à 8 et 13 degrés de liberté et avec une probabilité de 95 %).

Discussion
Couverture séquentielle et identification de résidus modifiés
La plupart des modifications ont été observées grâce à l’endoprotéïnase Glu C. La compréhension des conditions de protéolyse comme le rapport enzyme/protéine permet d’augmenter la couverture séquentielle et ainsi de gagner des informations sur les résidus potentiellement modifiés. L’endopro-téïnase Glu C n’oublient pas de coupures (Tableau 1), tandis que la trypsine en oublient fréquemment une ou deux. Lorsque le rapport enzyme/protéine est divisé par 10 (1/400e w/w), l’endoprotéïnase Glu C oublie plus de coupures (Tableau 2) et permet d’identifier d’autres résidus modifiés. Le peptide [232-253] contient 3 acides aminés de plus que le peptide [232-250] déjà observé avec un rapport enzyme/protéine 1/40e (w/w). L’identification de la séquence du peptide [232-250] et des résidus modifiés est ainsi confirmée (si besoin était). Le peptide [304-319] permet d’identifier 3 résidus potentiellement modifiés supplémentaires.
Une endoprotéinase doit produire des coupures spécifiques pour être exploitable avec un spectromètre MALDI-TOF linéaire, sinon l’éventail des séquences correspondant à une masse est trop large (Voir les coupures produites par l’endoprotéinase Arg C). La séquence pourrait être connue avec un spectromètre de masse MS/MS. La non-connaissance de la séquence d’un peptide n’exclut toutefois pas son utilisation à des fins de quantification.
Réactivité des fonctions amine
Sur 12 résidus modifiés dans le tampon MES et observés grâce aux 3 endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine, 2 possibilités s’offrent : soit 8 résidus Lysine et 4 résidus Arginine sont modifiés, soit 10 résidus Lysine et 2 résidus Arginine sont modifiés.
Localisation d’une modification
Les modifications de 8 ou 10 résidus sur les 12 résidus Lysine accessibles sont observées. Faute d’une couverture séquentielle faible (31 %), toutes les modifications n’ont probablement pas été localisées.
Sélectivité en fonction du pH
A pH = 5 (dans le tampon MES), la quasi-totalité des résidus Lysine accessibles sont modifiés par la chimie des anhydrides. Les résidus Arginine modifiés le sont faiblement à ce pH. Plus le pH est supérieur à 5, plus les résidus Arginine sont modifiés.
Quantification relative
Dans le cas de la protéine BSA, la quantification relative est satisfaisante sur le seul peptide [424-448] de masse 2878,2 Da. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque la référence (solution de plus grande concentration) a été acétylée. Les écarts observés sur l’essai pour lequel la référence a été propionylée peuvent être expliqués par la formation d’adduits +56 Da.
Conséquence pour l’intéraction immunospécifique.
Le recouvrement ou le non-recouvrement des épitopes connus de la protéine BSA avec les anticorps « AB3 » et « AB6 » déjà mentionnés avec les résidus Lysine et Arginine peut maintenant être estimé.
Pour l’anticorps AB3, l’épitope réside dans le résidu Met-546 (Tableau 14 plus loin) et les acides aminés proches. Aucune peptide ne contenant ce résidu n’a été observé. Le risque de voir l’intéraction immunospécifique avec AB3 perturbée par la chimie des anhydrides ne peut donc être connu. Pour l’anticorps AB6, l’épitope réside dans le peptide [299-338]. Une modification des peptides [304-319] et [318-337] obtenus par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C a été observée. Il y a donc un risque de voir l’intéraction immunospécifique avec AB6 perturbée par la chimie des anhydrides.
Conclusion – Objectifs
La faisabilité d’une modification de protéine d’une manière douce a pu être démontrée. Il est possible d’identifier et de quantifier de façon relative une protéine par spectrométrie de masse. L’expérience acquise montre qu’il faut étudier chaque protéine individuellement : modifier la protéine, mener les digestions protéolytiques, retrouver le ou les peptide(s) qui conduisent à une bonne quantification relative avec la chimie des anhydrides. Dans le futur, il est prévu d’étudier l’insuline, PSA (Peroxidase Prostate Spectific Antigen) et HRP (Horseradish Peroxidase).

Si la spécificité d’un anticorps donné avec une protéine est altérée par une modification chimique de celle-ci, il est envisageable de produire un anticorps spécifique de la protéine modifiée. Il faudra vérifier alors que la specificité est la même avec les deux protéines modifiées différentiellement. La spécificité de chaque anticorps devra être essayée indépendamment sur instrument BIACORE ou essai Western Blot.
Tous les outils sont maintenant disponibles pour l’union d’une quantification relative par modification chimique différentielle de protéines issues d’extraits cellulaires d’origine distincte et la séparation des protéines par intéraction immunospécifique (antigène-anticorps).
Il reste à élaborer d’autres coupures protéolytiques et chimiques possibles (coupure par le bromure de cyanogène CNBr, par l’acide formique HCOOH) et d’autres chimie de modification des protéines.

Epitopes Endoprotéinase
(T : Trypsine
G : Glu C
A : Arg C )
Peptide Résidu modifié Intensité
du pic
(f : faible
M : moyen
F : Fort)
T 66-75 f
T 89-105 ? K-100 M
G 155-164 K-155 / K-157 / K-161 M
T 156-167 f
T 161-167 f
G 165-176 R-167 / R-168 F
T 168-183 f
G 191-206 K-197 / K-204 f
T 198-211 f
T 205-218 f
A 223-232 M
G 232-250 R-232 / R-241
K-235 / K-245 / K-248 F
épitope
de AB6 299-338
G 304-319 K-304 / K-309 / K-318 M
G 318-337 K-318 / K-336 M
T 341-359 ? K-346 ? M
T 402-420 ? K-412 ?
T 421-433 F
G 424-448 R-433 / R-436 / K-437 F
A 437-451 K-437 f
T 508-523 M
T 549-561 M
épitope
de AB3 Met-546
Tableau 14 : Couverture séquentielle de la BSA,
peptides et résidus modifiés dans le tampon MES
et épitopes des anticorps AB3 et AB6.
(Les points d’interrogation signalent une séquence incertaine).

Bibliographie
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ZERZERI SAMI ANNEE 2001-2002

STAGE DE DESS « ANALYSE ET ETUDES STRUCTURALES
EN CHIMIE ORGANIQUE ET BIOLOGIQUE »

COMPARAISON QUANTITATIVE DE PROTEINE
PAR SPECTROMETRIE DE MASSE
(ANNEXES)

MAITRE DE STAGE : IVO GLYNNE GUT, PHD
HEAD OF TECHNOLOGY DEVELOPMENT
TELEPHONE : 01 60 87 83 59

CENTRE NATIONAL DE GENOTYPAGE
BATIMENT G2
2 RUE GASTON CREMIEUX
CP 5721
91057 EVRY CEDEX

Annexes

Figure en annexe n° 1 : processus analytique.

Figure en annexe n° 2 : Les anhydrides homologues acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da.

Figure en annexe n° 3 : Structure du réactif ICAT. Le réactif est composé de 3 éléments : un marqueur d’affinité (Biotine), une chaîne alkyle portant 8 isotopes purs H ou D et un groupe réactif des résidus thiols.

Figure en annexe n° 4 : Réaction des anhydrides avec la fonction amine N-terminal, les fonctions amine primaire du résidu Lysine et guanidine du résidu Arginine.

Figure en annexe n° 6 : coupures par les endoprotéïnases trypsin, Arg C, Glu C et Asp N du fragment 25-60 de la BSA.

Position de la position de la première coupure Nom de l’endoproteinase Séquence du peptide contenant le résidu
N-terminal Longueur du peptide en nb d’a.a. Masse du peptide [Da]
29 Trypsine DTHK 4 499.239
31 Glutamyl endopeptidase DTHKSE 6 715.314
35 Arg-C proteinase DTHKSEIAHR 10 1192.595
37 Asp-N endopeptidase DTHKSEIAHRFK 12 1467.758
Tableau en annexe n° 1 : longueur et masse des peptides produits
par les Endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine.

Nom de l’enzyme Spécificité de l’enzyme Fréquence des résidus dans BSA Nb. de coupures Positions des sites de coupures
Trypsine K,R 14 % 6 29 35 37 45 66 76
Glu C endopeptidase E,D 17 % 6 31 41 42 63 70 73
Arg-C proteinase R 3,9 % 1 35
Asp-N endopeptidase D 6,9 % 3 37 61 70
Tableau en annexe n° 2 : Nombre de coupures produites en fonction de la fréquence des résidus
et de la spécificité d’une endoprotéinase

Document 1: couverture séquentielle de la BSA obtenue grâce à la tryspine (26 %)
avec le logiciel Protein-Prospector-MS FIT
MS-Fit Search Results
Parameters
Database searched: SwissProt.8.17.2002
Digest Used: Trypsine
Max. # Missed Cleavages: 3
Peptide N terminus: Hydrogen
Peptide C terminus: Free Acid
Cysteine Modification: unmodified
Instrument Name: MALDI-TOF
Sample ID (comment): Magic Bullet digest
Minimum Matches: 4
Sort Type: Score Sort
Considered modifications: | Peptide N-terminal Gln to pyroGlu | Oxidation of M | Protein N-terminus Acetylated |
Min Parent Ion Matches: 1
MOWSE On: 1
MOWSE P Factor: 0.4
Detailed Results
1. 12/19 matches (63%).
Acc. #: P02769 Species: BOVIN Name: Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6)
Index: 79329 MW: 69294 Da pI: 5.8

m/z
Submitted MH+
Matched Delta
Da Modifications Start End Missed
Cleavages Database
Sequence
927.4185 927.4940 -0.076 161 167 0 (K) YLYEIAR (R)
1163.3385 1163.6312 -0.29 66 75 0 (K) LVNELTEFAK (T)
1479.3211 1479.7960 -0.47 421 433 0 (K) LGEYGFQNALIVR (Y)
1486.6313 1487.8950 -1.3 pyroGlu 549 561 1 (K)QTALVELLKHKPK(A)
1567.2930 1567.7433 -0.45 347 359 0 (K) DAFLGSFLYEYSR (R)
1574.8172 1573.8531 0.96 156 167 2 (K) KFWGKYLYEIAR (R)
1589.9195 1588.8555 1.1 198 211 2 (K) GACLLPKIETMREK (V)
1589.9195 1590.8638 -0.94 205 218 2 (K) IETMREKVLASSAR (Q)
1823.0762 1823.9002 -0.82 508 523 0 (R) RPCFSALTPDETYVPK (A)
1888.4944 1887.0711 1.4 212 228 3 (K) VLASSARQRLRCASIQK (F)
1888.4944 1888.9274 -0.43 169 183 0 (R) HPYFYAPELLYYANK (Y)
1888.4944 1888.9955 -0.50 89 105 1 (K) SLHTLFGDELCKVASLR (E)
1945.6345 1947.0928 -1.5 229 245 3 (K) FGERALKAWSVARLSQK (F)
2044.1906 2045.0285 -0.84 168 183 1 (R) RHPYFYAPELLYYANK (Y)
2299.8202 2301.0828 -1.3 341 359 1 (K) NYQEAKDAFLGSFLYEYSR (R)

Figure en annexe n° 7 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)

Masse
calculée différence
de masse
Séquence Peptide
Coupure
oubliée Positions
des résidus K et R
2521.16 -0.5 (P)LTADFAEDKDVCKNYQEAKDAF(L) 328-349
0 K-336 ; K-340; K-346
2521.16 -0.5 (L)TADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL(G) 329-350
0 K-336 ; K-340; K-346
2521.43 -0.23 (R)/LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTK(V) 242-263
0 K-246 ; K-249; K-257 ; K-264
2015.86 -0.22 (L)TKVHKECCHGDLLECADD(R) 262-279
0 K-263 ; K-266
2015.87 -0.22 (E)CCAKDDPHACYSTVFDKL(K) 383-400
0 K-386 ; K-399
2015.91 -0.18 (G)DELCKVASLRETYGDMAD(C) 96-113
0 K-100 ; R-105
2015.91 -0.17 (C)VADESHAGCEKSLHTLFGD(E) 78-96
0 K-88
2015.94 -0.15 (A)EDKDVCKNYQEAKDAFL(G) 334-350
0 K-336 ; K-340; K-346
2015.97 -0.11 (T)LFGDELCKVASLRETYGD(M) 93-110
0 K-100 ; R-105
2016 -0.09 (S)FLYEYSRRHPEYAVSV(L) 353-368
1 R-359 ; R-360
2016.04 -0.05 (F)LSHKDDSPDLPKLKPDPN(T) 127-144
0 K-130 ; K-138; K-140
2016.04 -0.04 (C)PFDEHVKLVNELTEFAK(T) 59-75
0 K-65 ; K-75
2016.11 0.028 (R)/EKVLASSARQRLRCASIQ(K) 210-227
2 K-212 ;
R-208; R-219 ; R-221 ; R-223
Tableau en annexe n° 3 : Séquences possibles pour les peptides de masse 2016,0 Da et 2520,0 Da
(coupures non spécifiques)
(Différence de masse maximum de 0,5 Da).

Figure en annexe n° 8 : Digestion par l’endoprotéinase Arg C de la BSA
(Conditions de réaction : tampon MES : pH = 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)

Figure en annexe n° 9 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w)
du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1837,5 Da [ 304-319]
de séquence KPLLEKSHCIAEVEKD (3 coupures oubliées).
Résidus potentiellement modifiés : K-304 / K-309 / K-318.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)

Figure en annexe n° 10 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w)
du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2560.8 Da [ 232-253]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAEFVE (1 coupure oubliée).
Résidus potentiellement modifiés : R-232 / K-235 / R-241 / K-245 / K-248.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)

Figure en annexe n° 11 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1888,5 Da [89-105]
de séquence SLHTLFGDELCKVASLR.
Résidu potentiellement modifié : K-100
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux. Figure en annexe n° 12 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2300 Da [ 402-420]
de séquence HLVDEPQNLIKQNCDQFEK
ou [341-359] de séquence NYQEAKDAFLGSFLYEYSR.
Résidus potentiellement modifiés : K-412 ou K-346.
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux.

Figure en annexe n° 13 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1639,5 Da [437-451]
de séquence KVPQVSTPTLVEVSR.
Résidus potentiellement modifiés : K-437.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)

Digestion de la protéine non modifiée.
Digestion de la protéine acétylée seule.
Digestion de protéine propionylée seule. Figure en annexe n° 14 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2016,1 Da
de séquence inconnue (coupure non spécifique).
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)
1. Digestion de la protéine non modifiée.
2. Digestion de la protéine acétylée seule.
3. Digestion de protéine propionylée seule.

Figure en annexe n° 15 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2521,7 Da
de séquence inconnue (coupure non spécifique).
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)
Digestion de la protéine non modifiée.
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.

Figure en annexe n° 16 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-232/K-235/R-241/K-245/K-248.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium : pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.
Figure en annexe n° 17 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium :
pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.

Figure en annexe n° 18 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium : pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.
Figure en annexe n° 19: Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448]
de séquence
YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE.
R-433/R-436/K-437.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.

Figure en annexe n° 20 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-197/K-204.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium :
pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.
Figure en annexe n° 21 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
1ère modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-232/K-235/R-241/K-245/K-248.
2ème modification localisée sur le peptide de masse 2198,7 Da [318-337] de séquence KDAIPENLPPLTADFAEDKD.
Résidus potentiellement modifiés :
K 318/K 336.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.

Figure en annexe n° 22 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,02.
2. anhydride/protéine = 0,08.
3. anhydride/protéine = 0,17.
4. anhydride/protéine = 0,34. Figure en annexe n° 23 : Propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,02.
2. anhydride/protéine = 0,08.
3. anhydride/protéine = 0,17.
4. anhydride/protéine = 0,34.

Figure en annexe n° 24 : Les anhydrides propionique réagit avec le tampon acide acétique/acétate de sodium pour donner l’anhydride mixte acétopropionique qui acétyle le résidu Lysine.

Figure en annexe n° 25 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence GFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 26 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés : K-197/K-204
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Figure en annexe n° 27 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5).
Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 28 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Figure en annexe n° 29 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-197/K-204.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 30 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Nom de l’enzyme
Spécificité de
l’enzyme Fréquence des résidus dans
BSA peptides produits en théorie
(avec
0 coupures oubliées) peptides produits expérimentalement
Trypsine K,R 14% 55 dont 34 ont une masse supérieure à 900 Da 9
de masse supérieure
à 900 Da
Glu C endopeptidase E,D 17% 53 dont 27 ont une masse supérieure à 900 Da 5
de masse supérieure
à 900 Da
Tableau en annexe n° 4 : Nombre de peptides produits en théorie et en pratique
par les protéases Trypsine et Glu C.
2880 424-448 YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE
2483 42-62 HFKGLVLIAFSQYLQQCPFD E
2348 211-231 KVLASSARQRLRCASIQKFG E
2186 232-250 RALKAWSVARLSQKFPKAE
2135 399-416 KLKHLVDEPQNLIKQNCD
1821 449-465 VSRSLGKVGTRCCTKPE
1805 503-518 SLVNRRPCFSALTPDE
1722 177-190 LLYYANKYNGVFQE
1686 475-488 YLSLILNRLCVLHE
1583 136-149 LPKLKPDPNTLCDE
1520 165-176 IARRHPYFYAPE
1362 364-375 YAVSVLLRLAKE
1362 155-164 KKFWGKYLYE
1294 555-565 LLKHKPKATEE
1286 544-554 KQIKKQTALVE
1285 595-607 GPKLVVSTQTALA
1255 388-398 DPHACYSTVFD
1147 88-97 KSLHTLFGDE
1072 197-206 KGACLLPKIE
1070 519-527 TYVPKAFDE
1047 348-356 AFLGSFLYE
1019 98-106 LCKVASLRE
983 73-81 FAKTCVADE
979 528-535 KLFTFHAD
944 357-363 YSRRHPE
911 495-502 KVTKCCTE
906 293-300 TISSKLKE
Tableau en annexe n° 5 : Peptides produits en théorie
par digestion par l’endoprotéïnase Glu C avec 0 coupures oubliées.

Table des figures

Figure 1 : couverture séquentielle de la BSA (digestion par la trypsine, l’endoprotéïnase Glu C et l’endoprotéinase Arg C ). 8
Figure 2 : Absorbance à 420 nm du complexe trinitrophenyl-amine-ion sulfite. 9
Figure 3 : Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA 9
Figure 4 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5 ; anhydride/protéine = 0,06). Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 9
Figure 5 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. 11
Figure 6 : Rapports expérimentaux des intensités du pic correspondant à la concentration variable sur le pic correspondant à la référence en fonction du rapport formulé. 16
Figure 7 : Propionylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence). Acétylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08). 17
Figure 8 : Acétylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence). Propionylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08). 17

Tables des figures en annexe
Figure en annexe n° 1 : processus analytique. 24
Figure en annexe n° 2 : Les anhydrides homologues acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da. 24
Figure en annexe n° 3 : Structure du réactif ICAT. Le réactif est composé de 3 éléments : un marqueur d’affinité (Biotine), une chaîne alkyle portant 8 isotopes purs H ou D et un groupe réactif des résidus thiols. 25
Figure en annexe n° 4 : Réaction des anhydrides avec la fonction amine N-terminal, les fonctions amine primaire du résidu Lysine et guanidine du résidu Arginine. 25
Figure en annexe n° 6 : coupures par les endoprotéïnases trypsin, Arg C, Glu C et Asp N du fragment 25-60 de la BSA. 26
Figure en annexe n° 7 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. 28
Figure en annexe n° 8 : Digestion par l’endoprotéinase Arg C de la BSA 30
Figure en annexe n° 9 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w) du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 1837,5 Da [ 304-319] 31
Figure en annexe n° 10 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w) du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 2560.8 Da [ 232-253] 32
Figure en annexe n° 11 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 1888,5 Da [89-105] 33
Figure en annexe n° 12 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 2300 Da [ 402-420] 33
Figure en annexe n° 13 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 1639,5 Da [437-451] 34
Figure en annexe n° 14 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 2016,1 Da 34
Figure en annexe n° 15 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 2521,7 Da 35
Figure en annexe n° 16 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250] 36
Figure en annexe n° 17 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448] 36
Figure en annexe n° 18 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 37
Figure en annexe n° 19: Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448] 37
Figure en annexe n° 20 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 38
Figure en annexe n° 21 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. 38
Figure en annexe n° 22 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 39
Figure en annexe n° 23 : Propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 39
Figure en annexe n° 24 : Les anhydrides propionique réagit avec le tampon acide acétique/acétate de sodium pour donner l’anhydride mixte acétopropionique qui acétyle le résidu Lysine. 40
Figure en annexe n° 25 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 41
Figure en annexe n° 26 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 41
Figure en annexe n° 27 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 42
Figure en annexe n° 28 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 42
Figure en annexe n° 29 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 43
Figure en annexe n° 30 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 43

Index des tableaux
Tableau 1 : peptides produits par l’endoprotéïnase Glu C (1/40e w/w). 7
Tableau 2 : peptides supplémentaires produits par l’endoprotéïnase Glu C (1/400e w/w). 7
Tableau 3 : les 2 séquences possibles pour le peptide de masse 1888,5 Da. 10
Tableau 4 : les 2 séquences possibles pour le peptide de masse 2300 Da. 10
Tableau 5 : le résidu modifié de séquence identifiable observé par digestion avec l’endoprotéïnase Arg C. 10
Tableau 6 : les 10-11 résidus potentiellement modifiés dans le tampon MES observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 11
Tableau 7 : Modifications observées sous toutes conditions de réaction et de digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 12
Tableau 8 : les résidus modifiés et observés dans le tampon monohydrogénophosphate observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 13
Tableau 9 : Progression de la réaction d’acétylation en fonction de la quantité d’anhydride (mesuré par le rapport ). 15
Tableau 10 : Progression de la réaction d’acétylation en fonction de la quantité d’anhydride (mesuré par le rapport ). 15
Tableau 11 : Réactivités comparées des 2 réactifs homologues en fonction de la quantité d’anhydride. 15
Tableau 12 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à l’acétylation sur l’intensité du pic correspondant à la propionylation en fonction du rapport des concentrations formulées. 18
Tableau 13 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à la propionylation sur l’intensité du pic correspondant à l’acétylation en fonction du rapport des concentrations formulées. 18
Tableau 14 : Couverture séquentielle de la BSA, peptides et résidus modifiés dans le tampon MES et épitopes des anticorps AB3 et AB6. 21

Index des tableaux en annexe
Tableau en annexe n° 1 : longueur et masse des peptides produits par les Endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine. 26
Tableau en annexe n° 2 : Nombre de coupures produites en fonction de la fréquence des résidus et de la spécificité d’une endoprotéinase 26
Tableau en annexe n° 3 : Séquences possibles pour les peptides de masse 2016,0 Da et 2520,0 Da (coupures non spécifiques) 29
Tableau en annexe n° 4 : Nombre de peptides produits en théorie et en pratique par les protéases Trypsine et Glu C. 44
Tableau en annexe n° 5 : Peptides produits en théorie par digestion par l’endoprotéïnase Glu C avec 0 coupures oubliées. 44

Index

absorbance 5, 10
acide acétique 14, 29, 34, 38, 39, 40, 41, 47
acide formique 21
adduit cationique +56 Da 11
adduits +56 Da 20
agrégats matriciels 4
antigène-anticorps 2, 3, 21
Arg C 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 20, 22, 27, 31, 35, 36
BIACORE 3, 21
CNBr 21
concentration du tampon 6
coupure non spécifique 11, 35, 36
coupures non spécifiques 30
Couverture séquentielle 7, 20, 22
détergent 4, 5
disulfure 2, 3, 5
DTT 1, 4, 5
durée de digestion 4, 6
enzyme/protéine 4, 6, 7, 8, 12, 20, 32, 33, 46
épitopes 3, 20, 22
FINDPEPT 7, 13
gels bidimensionnels 2
Glu C 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22, 27, 32, 33, 45
guanidine 3, 14, 26, 46
HCCA 1, 4, 5, 7
Horseradish Peroxidase 21
ICAT 2, 26
insuline 21
intéraction immunospécifique 2, 3, 21
iodoacétamide 5
matrice 4, 5, 7
méthode à évaporation rapide 7
méthode de la goutte séchée 7
méthode des 2 couches 7
monohydrogénophosphate 14, 37, 38, 48
MS FIT 7, 28
MS/MS 10, 12, 20
OGP 1, 5
Peroxidase Prostate Spectific Antigen 21
pH 3, 5, 6, 10, 12, 14, 18, 20, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44
phenylisothiocyanate 1
potassium K+ 6
Purification sur phase inverse 6
résidus Lysine accessibles 5, 10
résine échangeuse d’ion 5, 6
SEPHADEX G25 fine 6
sodium 5, 14, 29, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 47
sodium Na+ 6
stringence 5
température de digestion 6
TFA 6, 7
THF 1, 5, 6
trypsine 4, 20
urée 5
ZIPTIP 6

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Akon – I Can’t Wait
Akon – I Wanna Love You ft. Snoop Dogg
Akon – I’m So Paid ft. Lil Wayne, Young Jeezy
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Bob Sinclar – I Feel For You
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Bob Sinclar – World, Hold On
Bob Sinclar Feat. Dawn Tallman – Feel The Vibe (Official Video)
Bob Sinclar Feat. Dollarman & Big Ali & Makedah – Rock This Party (Everybody dance now)
Bob Sinclar Feat. Steve Edwards – Together

Bruno Mars – Grenade [Official Music Video]
Bruno Mars – The Lazy Song [Official Video]
Bruno Mars – Treasure [Official Music Video]
Bruno Mars – When I Was Your Man [Official Video]

Call Me Maybe by Carly Jae Repsen (COVER)

Calvin Harris & Alesso – Under Control ft. Hurts
Calvin Harris – Feel So Close

Cascada – Summer Of Love (Official Video)
Cascada – The Rhythm of The Night (Official Video)

Charlie Puth – Marvin Gaye ft. Meghan Trainor [Official Video]

Chris Brown – Turn Up The Music

Christina Aguilera – Beautiful

Coldplay – Clocks
Coldplay – Paradise
Coldplay – Princess Of China ft. Rihanna

Coppens-Il-n-y-a-plus-de-race-depuis-que-l-homme-est-homme-1444679

Corona – The Rhythm of the Night [HQ]

Cris Cab – Liar Liar

Curtis Mayfield – Move On Up

D gouli wech

Demi Lovato – Cool for the Summer (Official Video)

Developers

Diddy – Dirty Money – Coming Home ft. Skylar Grey

Dimitri Vegas & Like Mike feat. Ne-Yo – Higher Place (Official Music Video)

Disclosure – Latch feat. Sam Smith (Official Video)

DJ-ABDEL-funk_you_HD.mov

Don’t You Worry Child (Live)

Donna Summer Love To Love You Baby original long version (Disco 70s)

Dr. Dre – The Next Episode ft. Snoop Dogg, Kurupt, Nate Dogg

Earth, Wind & Fire – Fantasy
Earth, Wind & Fire – Let’s Groove
Earth, Wind & Fire – September

Elvis – A Little Less Conversation

Empire Cast – Good Enough (feat. Jussie Smollett)
Empire Cast – You’re So Beautiful (feat. Jussie Smollett and Yazz)
Empire State of Mind Jay-Z _ Alicia Keys [OFFICIAL VIDEO]

Eric Clapton – Change The World

Estelle – American Boy [Feat. Kanye West] [Video]

Faul & Wad Ad vs. Pnau – Changes (official video)

Flo Rida – Club Can’t Handle Me ft. David Guetta [Official Music Video] – Step Up 3D
Flo Rida – Good Feeling [Official Video]
Flo Rida – How I Feel [Official Video]
Flo Rida – I Cry [Official Video]
Flo Rida – Let It Roll [Official Video]
Flo Rida – Whistle [Official Video]
Flo Rida – Wild Ones ft. Sia [Official Video]

George Benson – Give Me The Night

George Gershwin – I got rhythm

Gouli wech eli tridi

Gradur – Rosa

GTA Vice City Radio – Fever 105 – Fat Larry’s Band – Act Like You Know

Guru Josh – Infinity 2012 (Official Video)

Haddaway – What Is Love

Have Love, Will Travel – The Sonics

IAM – Elle Donne Son Corps Avant Son Nom
IAM feat. DjKamini83 – — Nés Sous La Même Etoile — _Remix_
IAM-Nés sous la même étoile

Ice MC – Easy (original video)

Ida Corr vs. Fedde Le Grand – Let Me Think About It

Imagination -Video- Body Talk

James Brown (sex machine)

Janet Jackson beenie man feel it bo_music

Jay Z Hard knock life

Jay-Z & Kanye West – Otis
Jay-Z – Excuse Me Miss ft. Pharrell
Jay-Z – I Just Wanna Love U (Give It 2 Me)

Jess Glynne – Don’t Be So Hard On Yourself [Official]
Jess Glynne – Hold My Hand [Official Video]

John Newman – Love Me Again

Jrit Wjar

jrou7i mabrat

Justin Timberlake – Rock Your Body
Justin Timberlake feat.Snoop Dogg & Charlie Wilson_ Signs Lyrics

K-Ci & JoJo – All My Life

Kanye West – Flashing Lights ft. Dwele
Kanye West – Gold Digger ft. Jamie Foxx
Kanye West – Good Life ft. T-Pain
Kanye West – Heard ‘Em Say ft. Adam Levine
Kanye West – Love Lockdown
Kanye West – Stronger
Kanye West – Touch The Sky (MTV Version) ft. Lupe Fiasco

Katy Perry – California Gurls ft. Snoop Dogg

Kid Cudi vs. Crookers – Day ‘n’ Night

Klay BBJ – Culture 7wem Vol.2
Klay_BBJ_Hamzaoui_Med_Amine_-_wa9tech

Kool & The Gang – Be My Lady
Kool & The Gang – Celebration
Kool & the Gang – Get Down On It
Kool & The Gang – Joanna
Kool & The Gang – Straight Ahead (12)
Kool & The Gang – Sugar
Kool & The Gang – Tonight
Kool and The Gang – Big fun 1982
Kool And The Gang – Too Hot
kool and the gang steppin out

LASHAB ILI KANOU

Laurent Wolf – No Stress

Lotfi Ben Zina _ ?? ????? ????

lotfi jormana ( nebki ya w5ayeni )

Louis Armstrong – When The Saints Go Marching In

Lykke Li – I Follow Rivers (The Magician Remix)
Lykke Li I follow you

M.A.R.S. – Pump Up The Volume

MACKLEMORE & RYAN LEWIS – CAN’T HOLD US FEAT. RAY DALTON (OFFICIAL MUSIC VIDEO)
MACKLEMORE & RYAN LEWIS – THRIFT SHOP FEAT. WANZ (OFFICIAL VIDEO)

Madcon – Don’t Worry (Official Lyric Video) ft. Ray Dalton

Marina Kaye – Homeless – Clip officiel

Marky Mark And The Funky Bunch – Good Vibrations

Maroon 5 – Misery (UK Version)

Marvin Gaye – Mercy Mercy me
Marvin Gaye – I Heard It Through The Grapevine
Marvin Gaye – I Want You (1976)
Marvin Gaye – Lets get it on
Marvin Gaye – What’s Going On
Marvin Gaye~Got to give it up

MC Hammer – U Can_’t Touch This

Mel & Kim – Respectable

Michael Gray – The Weekend (Official Video HQ)

Michael Jackson – Another Part Of Me
Michael Jackson – Rock With You
Michael Jackson – You Rock My World
Michael Jackson, Justin Timberlake – Love Never Felt So Good
Michael Jackson- In The Closet (HD 720P)

Mister You – A Toi…

Moves Like Jagger – Maroon 5 featuring Christina Aguilera

Mr Probz – Waves (Roter & Lewis Edit) [Lyrics]
Mr Probz – Waves (Official Video) [Robin Schulz Remix]

mrcriskimo__ nbereklek w 3azinii

Naughty Boy – La La La ft. Sam Smith wLyrics
Naughty Boy – Runnin’ (Lose It All) ft. Beyoncé, Arrow Benjamin

Next – Too Close

One Mint Julep – Ray Charles (1961)

Diddy And Usher Feat. Loon – I Need A Girl
Diddy Feat. Keyshia Cole – Last Night [HD 720p]

Pharrell Williams ft. Jay-Z – Frontin’

Prefab Sprout – Cars And Girls

Puff Daddy – I’ll Be Missing You (Official music video)
Puff Daddy Feat. R. Kelly – Satisfy You (HD)
Puff Daddy ft Mase – Can’t Nobody Hold Me Down (Explicit)

Kelly – Ignition (Remix)

R.I.O feat U- Jean – Summer Jam (Official Video)

REMADY feat. MANU-L GIVE ME A SIGN Videoclip
Remady – No Superstar (Official Video)

RIDSA – LA C’EST DIE (CLIP OFFICIEL)

Robin Schulz – Sugar (feat. Francesco Yates) (Official Lyric Video)

S-Express – Theme From S-Express.

SHE’S A BAD MAMA JAMA – Carl Carlton

Skee-Lo – I Wish (Official Video)

Snoop Dog ft pharell – beautiful
Snoop Dogg & Wiz Khalifa – Young, Wild and Free ft. Bruno Mars
Snoop Dogg – Boss’ Life ft. Nate Dogg
Snoop Dogg – Drop It Like It’s Hot ft. Pharrell Williams
Snoop Dogg – Gangsta Luv (DIRTY)  LYRICS 2009
Snoop Dogg – Sensual Seduction
Snoop Dogg – Ups & Downs. Bang Out
Snoop Dogg – Wet
Snoop Dogg, Pharrell Williams – Let’s Get Blown (Unedited)
Snoop Dogg, Pharrell Williams – Let’s Get Blown
Snoop doggy dogg – aint no fun (if the homies cant get none)

Sobi kassi sobi

Soul II Soul – Keep On Movin’

Stromae – Tous Les Mêmes

Sunshine reggae – Laid Back

Superfunk – the young Mc contact for dj booking

Superhuman

Taio Cruz – Break Your Heart ft. Ludacris

Technotronic – Pump Up The Jam

The Beatles – And I Love Her

The Beatmasters Rok Da House Video 1987

The Black & White Brothers – Pump It Up (Radio Mix)
The Black & White Brothers – Pump It Up (Extended Mix)
THE BLACK & WHITE BROTHERS – Pump It Up! (Accapella-Disco Version) 1998

The Black Eyed Peas – Boom Boom Pow
The Black Eyed Peas – Don’t Stop The Party
The Black Eyed Peas – I Gotta Feeling
The Black Eyed Peas – Just Can’t Get Enough
The Black Eyed Peas – Pump It
The Black Eyed Peas – Shut Up

The Game, 50 Cent – Hate It Or Love It

The Human League – Don’t You Want Me

The Isley Brothers-Who’s That lady

The Shin Sekaï – Du berceau au linceul (clip officiel)

Timbaland – The Way I Are ft. Keri Hilson, D.O.E., Sebastian

Warren G – Regulate ft. Nate Dogg

Wham! – Last Christmas

Who’s that Lady – The Isley Brothers – HQ

Young MC – Bust A Move

Zara Larsson – Lush Life (Audio)

Zinouba

Sur mon compte Napster.

Dans le détail :

Gymnopédie N° 1 (Erik Satie)
Histoire De La Forêt Viennoise (Johann Strauss)
La Donna E Mobile – Rigoletto (Giuseppe Verdi)
La Force Du Destin (Giuseppe Verdi)
Le Lac Des Cygnes – Entrée (Piotr Ilitch Tchaïkovski)
Les Quatre Saisons – Concerto N° 2 – L’été – Allegro (Antonio Lucio Vivaldi)
Les Quatre Saisons – L’hiver – Largo (Antonio Lucio Vivaldi)
Peer Gynt – Suite N° 1 (Edvard Hagerup Grieg)
Peer Gynt – Suite N° 2 – Opus 55 (Edvard Hagerup Grieg)

2Pac

I Get Around (Album Version (Explicit))

A Tribe Called Quest

Award Tour

Al Green

Call Me (Come Back Home)

Alex Ferrari

Bara Bara Bere Bere

Amr Diab

Adit El Ayam
Al Leila
Ahla W Ahla
Al Leila
Allah Ala Hobak
Amentak
Andy Suwal
Banadeek Ta’ala
Heya Hayaty
Inta El Ghaly
Khalik Ma’aya
Ma’ak Bartaah
Maak Alby
Qusad Einy
Rasmaha
Tagroba Wa Addet
Tamally Ma Aak
Wayah

Amy Winehouse

Love Is A Losing Game

Anita Baker

Sweet Love

Aretha Franklin

I Say A Little Prayer

Respect

Ariana Grande

Side To Side
Dangerous Woman

B.B. King

Every Day I Have the Blues

Babyface

Hero
We’ve Got Love
Return Of The Tender Lover

Baltimore Symphony Orchestra

Romeo & Juliet, Op. 64, Act III: No. 46, Juliet’s Room
Prokofiev: Romeo & Juliet, Op. 64

Barry White

Never Gonna Give You Up

Big Daddy Kane

Ain’t No Half-Steppin’
Long Live The Kane

Billie Holiday

Pennies from Heaven

Billy Paul

Am I Black Enough For You
Me And Mrs. Jones: The Best Of Billy Paul

Bing Crosby

April Showers
Dinah
Dinah – (with The Mills Brothers)
Honeysuckle Rose
Ol’ Man River
Pennies from Heaven
Swanee
Sweet Georgia Brown

Bing Crosby

April Showers
Dinah
Dinah – (with The Mills Brothers)
Honeysuckle Rose
Ol’ Man River
Pennies from Heaven
Swanee
Sweet Georgia Brown

Black & White Brothers

Pump It Up! (Extended Mix)
Pump It Up! (Radio Mix)

Bobby Womack

Across 110th Street

Bruno Mars

24K Magic
Chunky
Finesse
Straight Up & Down
That’s What I Like

Bryson Tiller

Don’t

C2C

Happy featuring Derek Martin

Calvin Harris

Don’t Quit
Feels
One Kiss
One Kiss (Valentino Khan Remix)
One Kiss (Remixes)
Summer
This Is What You Came For (feat Rihanna)

Chaka Khan

Ain’t Nobody

Charles Bradley

Good to Be Back Home

Charles Wright and the Watts 103rd Street Rhythm Band

Express Yourself

Chic

Good Times

Chris Brown

Loyal

The Commodores

Nightshift (Single Version)

The Communards

Don’t Leave Me This Way

Craig David

7 Days

D’Angelo

Really Love

Daft Punk

Superheroes / Human After All / Rock’n Roll

David Guetta

Bang my Head (feat. Sia & Fetty Wap)
Choose (feat. Ne-Yo & Kelly Rowland)
Gettin’ Over (feat. Chris Willis)
Gettin’ Over You (feat. Fergie & LMFAO)
Grrrr
How Soon Is Now
How Soon Is Now (Dirty South)
I Wanna Go Crazy (feat. will.i.am)
If We Ever (feat. Makeba)
It’s The Way You Love Me (feat. Kelly Rowland)
It’s your life (feat. Chris Willis)
Louder Than Words (feat. Niles Mason) [Radio Edit]
Memories
Memories (feat. Kid Cudi)
Memories (feat. Kid Cudi) [F*** Me I’m Famous ! Remix Edit]
Missing You (feat. Novel)
Missing You (feat. Novel) [New Version]
Missing You (feat. Novel) [New Version]
On The Dancefloor (feat. will.i.am & apl.de.ap)
One Love (feat. Estelle)
Sexy Bitch (feat. Akon)
Sexy Bitch (feat. Akon) [Chuckie & Lil Jon Remix] [Edit]
Sound Of Letting Go
Sound Of Letting Go (feat. Chris Willis)
Toyfriend (feat. Wynter Gordon)
When Love Takes Over (feat. Kelly Rowland)
Who’s That Chick ?
Who’s That Chick ? (feat. Rihanna)

Demon (FR)

You Are My High

Deorro

I Can Be Somebody

Depeche Mode

Enjoy the Silence (2006 Digital Remaster)

Diana Ross

Upside Down

Dinah Washington

Blue Gardenia
Mad About the Boy
September In the Rain
Since I Fell For You

Dionne Warwick

Walk On By

DJ Antoine

Ma Chérie 2k12 featuring The Beat Shakers (DJ Antoine Vs Mad Mark 2k12 Radio Edit)

DJ Khaled

(Intro) I’m so Grateful
Shining

Django Reinhardt

Swing Guitars

Don Redman

How’m I Doin’? (Hey-Hey)

Donna Summer

Bad Girls
Last Dance (Single Version)
Love To Love You Baby
This Time I Know It’s For Real (Live)

Donny Hathaway

The Ghetto

Earth, Wind & Fire

After the Love Has Gone
Boogie Wonderland (with The Emotions)
Can’t Hide Love
Fantasy
Reasons
September
Sing A Song
That’s The Way Of The World

Ed Sheeran

Galway Girl

Ella Fitzgerald

April in Paris
Blue Moon
Cow Cow Boogie
Istanbul
Stormy Weather
Memphis Blues
Misty
Star Dust
Blue Moon
Summertime

Empire Cast

Good Enough (feat. Jussie Smollett)
You’re So Beautiful (feat. Jussie Smollett and Yazz)

Etta James

A Sunday Kind of Love
I Just Want to Make Love to You
At Last – The Best Of Etta James
My One and Only
Stormy Weather
Gospel Blues

Fat Larry’s Band

Act Like You Know
Lookin for Love.

The Flamingos

I Only Have Eyes For You

Flo Rida

Good Feeling
I Cry
Let It Roll
Sweet Spot (feat. Jennifer Lopez)
Whistle
Wild Ones (feat. Sia)

Fontella Bass

Rescue Me

Frank Ocean

Thinkin Bout You

Frank Sinatra

Everybody Loves Somebody

George Michael

All the Man That I Need
Fastlove (Part 1)

Gilberto Gil

Palco

Guordan Banks

Keep You in Mind (Platinum Edition)

House of Pain

Jump Around

Howlin’ Wolf

Smokestack Lightning
Spoonful

IAM

Nés Sous La Même Étoile

Imagination

In and Out of Love
Music & Lights

The Isley Brothers

Between The Sheets

James Brown

Baby You’re Right
Bewildered
Get Up I Feel Like Being A Sex Machine featuring The Original J.B.s (Single Version (Parts 1 & 2))
Gonna Try
Good Good Lovin’
Got to Cry
Hold My Baby’s Hand
I Don’t Know
I Know It’s True
I Want You so Bad
I Won’t Plead No More
I’ll Go Crazy
I’ll Never Let You Go
If You Want Me
No, No, No, No
Papas Got a Brand New Bag
Please, Please, Please
Sex Machine
So Long
Think
Try Me
Wonder When You’re Coming Home
You’ve Got the Power

James Taylor

How Sweet It Is (To Be Loved By You)

Jamiroquai

Alright (Remastered for 2006)
Black Capricorn Day
Blow Your Mind (Remastered)
Emergency On Planet Earth
Butterfly
Canned Heat
Cosmic Girl (Remastered for 2006)
Deeper Underground (Full version)
Destitute Illusions
Falling
King For A Day
Planet Home
Soul Education
Supersonic
Virtual Insanity (Remastered)
When You Gonna Learn?

Jazmine Sullivan

10 Seconds
Don’t Make Me Wait
Excuse Me
Famous
Good Enough
Holding You Down (Goin’ In Circles)
Love You Long Time
Luv Back
Redemption
Stuttering
U Get On My Nerves

Jean Sablon

Il ne faut pas briser un rêve
Le doux caboulot
Plus rien n’existe
Rendez-vous sous la pluie
Rêverie
Seul
Si tu m’aimes
Stardust
Vous qui passez sans me voir

Jerry Lee Lewis

Whole Lotta Shakin Going On
He’s On Fire

Jess Glynne

Ain’t Got Far To Go
Don’t Be So Hard On Yourself
Gave Me Something
Hold My Hand
If I Can’t Have You (Radio Edit) (Saturday Night Fever)
My Love (Acoustic)
No Rights No Wrongs
Real Love
Saddest Vanilla (feat. Emeli Sandé)
Take Me Home
Why Me
You Can Find Me

John Newman

Gold Dust
Tribute

JUL

Ma jolie
Je ne me vois pas briller

Justin Timberlake

CAN’T STOP THE FEELING! (Original Song From DreamWorks Animation’s « Trolls »)

Kaaris

Boyz N The Hood
Poussière

Katy Perry

Feels
Last Friday Night (T.G.I.F.)

Kungs

Don’t You Know
Freedom
This Girl (Kungs Vs. Cookin’ On 3 Burners)

Lady Gaga

Poker Face

Lartiste

Clandestina

LeAnn Rimes

Can’t Fight The Moonlight

Lianne La Havas

Unstoppable

Mali Music

Heavy Love

Mariah Carey

Against All Odds (Take A Look At Me Now)
All I Want For Christmas Is You (So So Def Remix featuring Jermaine Dupri & Lil Bow Wow)
Fantasy
Fantasy (featuring O.D.B.)
Heartbreaker
Rainbow
Hero
Honey
I Know What You Want
The Remixes
I Still Believe
My All
Butterfly
Touch My Body
Touch My Body (Seamus Haji & Paul Emanuel – Radio Edit)
Touch My Body (Single Version)
We Belong Together
The Emancipation of Mimi
Without You

Marlena Shaw

Woman Of The Ghetto

Marmar

Mezwed Tunisian
Nehda 7abbah
Ya Dalloula

Maroon 5

Don’t Wanna Know

Martin Garrix

Forbidden Voices

Martin Tungevaag

Wicked Wonderland

Marvin Gaye

I Heard It Through The Grapevine

Maurane

Alfonsina Y El Mar
C’Est Magique
Je Voulais Te Dire Que Je T’Attends (B.O Du Film A La Folie Pas Du Tout)
Le Bonheur
Si Aujourd’hui
Les Antipodes
Mes Rivières Au Bord De L’Eau
Toutes Les Mamas
L’Un Pour L’Autre

Maurice Ravel

Bolero
Daphnis et Chloé Suite No. 2
Pavane pour une infante defunte

Mayer Hawthorne

Back Seat Lover
Where Does This Door Go

Mayra Andrade

Storia, storia

Maître Gims

Je te pardonne (Pilule Bleue)

MGK (Machine Gun Kelly)

Trap Paris
Bloom

Michael Bublé

Everything
Call Me Irresponsible

Michael Jackson

Beat It
Billie Jean (Single Version)
Can’t Let Her Get Away
Dangerous
Don’t Stop ‘Til You Get Enough
In The Closet
Love Never Felt So Good
She Drives Me Wild
The Lady In My Life
They Don’t Care About Us (Remastered Version)
Michael Jackson’s This Is It
Thriller
You Rock My World (Radio Edit)

Musiq Soulchild

Who Really Loves You
Life On Earth

Nancy Ajram

Ah W Noss
Enta Eih
Sallemouly Aleih
Ya Tabtab Wa Dallaa
Ya Tabtab

Nat King Cole

Sweet Lorraine
When I Fall in Love

Nick Jonas

Jealous

The Notorious B.I.G.

Machine Gun Funk

The O’Jays

Love Train

Otis Redding

[Sittin’ On] The Dock Of The Bay

P. Lion

Happy Children

Pharrell Williams

Feels
Gust Of Wind
Happy (from Despicable Me 2)

PNL

Bené

Portugal. The Man

Feel It Still

Quincy Jones

Ai No Corrida featuring Dune (Single Version)
Beat It
Billie Jean (Single Version)
Soul Bossa Nova
The Lady In My Life
The Midnight Sun Wil Never Set
The Birth of a Band

R. Kelly

Get Out Of Here With Me

Ramy Sabry

Agabetny
Bahebek Ya Omy
Bahess Beih
Dah Elly Bastannah
El Kalam Kolloh Aady – Live
Faker Zaman
Fi Eih
Ghammadt Einy
Gowwaya Hat’eish
Kelma
Law Hatta Mesh Shayfek
Ma Balash
Nefsy A’raf
Wemnein

Ray Charles

Hallelujah, I Love Her
Hit the Road Jack
I’ve Got A Woman
One Mint Julep

Remady

No Superstar (Full Vocal Mix)
No Superstar

Rick James

Freak Flag (Reprise)

Ripou

Zouj njoum

Ro James

Permission

Robert Glasper

Afro Blue (feat. Erykah Badu)

Sam Cooke

Summertime

Sarah Vaughan

You Got to My Head

Simply Red

Holding Back The Years (Single Version)
Money’s Too Tight (To Mention)
Something Got Me Started
.Sunrise

Sly & the Family Stone

Babies Makin’ Babies (Alternate Version)
Family Affair
Somebody’s Watching You

Solomon Burke

Everybody Needs Somebody To Love
Got To Get You Off My Mind

Solomon Grey

Firechild

T-Bone Walker

Every Day I Have The Blues

Teri Moise

Les poèmes de Michelle

Thelma Houston

Don’t Leave Me This Way
Love and Happiness
Don’t Leave Me This Way – Single
Medley: You Make Me Feel (Mighty Real) / Dance [Disco Heat]

Tina Charles

I Love To Love

 

Tony Bennett

Steppin’ Out With My Baby

Toots Thielemans

Barquinho
Aquarela Do Brasil

Usher

Yeah!

Various Artists

Mozart: Requiem

  1. Sequentia: Confutatis
  2. Sequentia: Lacrimosa

 

A Fool for You

Act Like You Know

 

Adagio en sol mineur

 

Ai No Corrida featuring Dune (Single Version)

All Stars

Bad Girls

Being With You (Single Version)

C’est si bon

Choose (feat. Ne-Yo & Kelly Rowland)

Dinah

Dream a Little Dream of Me

Fantasy (featuring O.D.B.)

Fresh

Gettin’ Over (feat. Chris Willis)

Gettin’ Over You (feat. Fergie & LMFAO)

Grease

Grrrr

How Soon Is Now

How Soon Is Now (Dirty South)

I Wanna Go Crazy (feat. will.i.am)

I’Ve Found a New Baby

If We Ever (feat. Makeba)

It’s The Way You Love Me (feat. Kelly Rowland)

It’s your life (feat. Chris Willis)

Je Voulais Te Dire Que Je T’Attends (B.O Du Film A La Folie Pas Du Tout)

Jungle Boogie

L’apprenti sorcier

Lahlou wel morr

Le couz

Taxi 5 (Bande originale inspirée du film)

Let Me Be Myself

Little Lila

Louder Than Words (feat. Niles Mason) [Radio Edit]

Ma Quale Idea

Mad About the Boy

Me, Myself And I

Memories

Memories (feat. Kid Cudi)

Memories (feat. Kid Cudi) [F*** Me I’m Famous ! Remix Edit]

Missing You (feat. Novel)

Missing You (feat. Novel) [New Version]

Missing You (feat. Novel) [New Version]

Moments Musical No.3 Opus 94

Move on Up

Music Sounds Better With You/Running (Mini Mix)

My One Temptation

Never Too Much

Nothin’ On You (feat. Bruno Mars)

Nothin’ Shakin’ (But the Leaves On the Trees)

On Da Rocks/Let’s Go Crazy/Technologic (Original)

On The Dancefloor (feat. will.i.am & apl.de.ap)

One Love (feat. Estelle)

Ouverture (Original)

Petite Musique De Nuit

Rapper’s Delight

Rhapsodie sur un thème de Paganini Op. 43 : Variation 18, Andante Cantabile

Sexy Bitch (feat. Akon)

Sexy Bitch (feat. Akon)

Sexy Bitch (feat. Akon) [Chuckie & Lil Jon Remix] [Edit]

Since I Fell For You

Sing It Back

Slave To The Vibe (Radio Edit)

Smokestack Lightning

Soul Bossa Nova

Sound Of Letting Go

Sound Of Letting Go (feat. Chris Willis)

Stay In My Corner

Stomp

Stomp! (Single Version)

Street Life

Suite bergamasque : I. Prélude

Suite bergamasque : III. Clair de lune

Symphonie No. 6 en si mineur Op. 74 « Pathétique » – Thème

Tamally Ma Aak

The Lark Ascending

Tout va très bien Madame la Marquise

Tout va très bien Madame la Marquise

Toyfriend (feat. Wynter Gordon)

Two Time Heart

Vous qui passez sans me voir

Walking By Myself

We Got The Funk

When I Fall in Love

When Love Takes Over (feat. Kelly Rowland)

Who’s That Chick ?

Who’s That Chick ? (feat. Rihanna)

Águas De Março

The Weeknd

I Feel It Coming

Wham!

Club Tropicana

Whitney Houston

All the Man That I Need
Saving All My Love For You

Wilson Pickett

In The Midnight Hour
Mustang Sally

Wu-Tang Clan

Protect Ya Neck
Triumph (Explicit Version)