Mes recherches sur les protéines en 2002.

SAMI ANNEE 2001-2002

STAGE DE DESS « ANALYSE ET ETUDES STRUCTURALES
EN CHIMIE ORGANIQUE ET BIOLOGIQUE »

COMPARAISON QUANTITATIVE DE PROTEINE
PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

MAITRE DE STAGE : IVO GLYNNE GUT, PHD
HEAD OF TECHNOLOGY DEVELOPMENT
TELEPHONE : 01 60 87 83 59

CENTRE NATIONAL DE GENOTYPAGE
BATIMENT G2
2 RUE GASTON CREMIEUX
CP 5721
91057 EVRY CEDEX

Je remercie pour leur bienveillance
mon professeur J.C.TABET
et mon maître de stage I.G.GUT
qui ont changé ma vie.

Sommaire
Sommaire 1
Abbréviations utilisées : 1
Le projet protéomique au CNG 2
Problèmatique chimique 2
Conséquence pour l’intéraction antigène-anticorps 3
Problèmatique analytique : Localisation d’une modification chimique 3
Méthodes expérimentales 5
Réactifs 5
Détermination du nombre de résidus Lysine accessibles dans une protéine 12 5
Réaction chimique avec les anhydrides 5
Digestion protéolytique 5
Purification sur phase inverse des peptides protéolytiques. 6
Méthode de déposition sur cible pour MALDI-TOF 6
Spectres MALDI-TOF 6
Logiciels d’identification des peptides 7
Résultats 7
Couverture séquentielle de la BSA 7
Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA 9
Chimie des anhydrides 9
Réactivités comparées des anhydrides homologues 14
Quantification relative sur des solutions de concentration différentes 16
Discussion 19
Couverture séquentielle et identification de résidus modifiés 19
Réactivité des fonctions amine 19
Localisation d’une modification 19
Sélectivité en fonction du pH 19
Quantification relative 19
Conséquence pour l’intéraction immunospécifique. 19
Conclusion – Objectifs 20
Bibliographie 22
Annexes 24
Table des figures 45
Tables des figures en annexe 45
Index des tableaux 47
Index des tableaux en annexe 47
Abbréviations utilisées :

• MALDI-TOF : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – Time of Flight.
• MES : 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
• HEPES : N-Hydroxyethyl Piperazine N2 Ethanesulfonic Acid.
• TFA : Acide TrifluoroAcétique
• HCCA : α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid.
• ICAT : Isotope Coded Affinity Tag.
• DTT : dithiothreitol.
• OGP : β-octyl glucopyrannoside.
• THF : tetrahydrofuranne.
• PITC : phenylisothiocyanate.
• TNBS : TrinitroBenzeneSulfonic acid.

• NM : pic du peptide non modifié.
• A1 : Acétylation d’un résidu.
• A2 : Acétylation de 2 résidus.
• A3 : Acétylation de 3 résidus.
• P1 : propionylation d’un résidu.
• P2 : propionylation de 2 résidus.
• P3 : propionylation de 3 résidus.

Le projet protéomique au CNG
Le projet dans lequel s’inscrit mon stage a pour sujet l’union de 2 principes : la quantification relative par modification chimique différentielle de protéines issues d’extraits cellulaires d’origine distincte et la séparation des protéines par intéraction immunospécifique (antigène-anticorps).
L’intégration des 2 principes constitue une nouveauté (d’ors et déjà brevetée). Cette méthode d’analyse a l’ambition de rem-placer les outils classiques de séparation et d’identification des protéines, tels que les gels bidimensionnels suivi d’une pro-téolyse intragel et après extraction, d’une analyse sur spectromètre de masse MALDI-TOF. Le problème de cette méthode est la quantification des protéines de basse expression souvent cachées par les protéines majoritaires.
Le projet étant à son commencement, il s’agit d’abord de montrer la faisabilité sur des protéines modèles pour lesquelles existent des anticorps commerciaux. Pour ce stage, seule l’albumine de serum bovin BSA est étudiée. En cas de succès de cette étape d’évaluation, la collaboration avec des laboratoires extérieurs permettra d’accéder à un très grand nombre d’anticorps et à l’intégration de ceux-ci dans des gels tridimensionnels1.
Problèmatique chimique
Le sujet du stage porte sur la faisabilité d’une modification chimique différentielle de protéines détectable par mesures des masses (avec un spectromètre MALDI-TOF) de peptides obtenus après digestion protéolytique (Figure en annexe n° 1). La modification différentielle consiste en une modification d’un résidu ou de plusieurs de la protéine par 2 réactifs homologues de même nature introduisant deux déplacements en masse différents. La modification des fonctions amine par les anhydride a été choisie pour sa simplicité et la disponibilité de 2 réactifs homologues. Les anhydrides acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da (Figure en annexe n° 2). La différence 14 Da est suffisante pour être résolue avec un spectromètre MALDI-TOF linéaire. La question est de savoir si les 2 réactifs homologues ont bien la même réactivité vis à vis d’une protéine, afin de valider la possibilité d’une quantification relative.
Il existe une chimie différentielle (ICAT pour Isotope Coded Affinity Tag 2,3), dont la quantification est basée sur une différence de 8 Da entre le réactif « léger » et le réactif « lourd » (réactif « léger » deutérié 8 fois (Figure en annexe n° 3). Une telle différence ne peut être résolue par un spectromètre MALDI-TOF linéaire de résolution moyenne à mi-hauteur 250. D’autre part, la chimie ICAT est qu’elle réagit avec les groupes thiols intervenant dans les ponts disulfure, ce qui est rédhibitoire pour sa structure tridimensionnelle, donc pour sa capture par un anticorps. De plus, la modification ICAT (C22H39N4O6S) est particulièrement encombrante.
Il est préférable d’employer une modi-fication chimique aussi peu encombrante que possible, comme par exemple les groupes acétyles.
Dans l’optique d’une moindre perturbation de la conformation de la protéine, il est nécessaire de maîtriser le nombre de résidus modifiés. La plupart des études sur le sujet proposent la modification de l’ensemble des fonctions amines primaires accessibles (au nombre de 12 en ce qui concerne la BSA : voir RESULTATS) et conduisent souvent à la perte de la confor-mation native de la protéine. Le nombre de marquages doit être suffisant pour être observables et utilisables en quantification sans modifier fondamentalement l’inté-raction antigène-anticorps. La question est de savoir si la fixation de la quantité de réactif ou la fixation du pH peuvent permettre de parvenir à cet objectif.
Une chaîne polypeptidique peut inclure un groupe α aminé, s’il n’est pas bloqué, et un nombre quelconque de fonctions ε-amine des groupes Lysines.
Tous ces groupes ont des réactivités similaires, mais les valeurs de pKa sont relativement différentes :
8 pour les fonctions α-amino et 10 pour les fonctions ε-amino.
Les fonctions amine sont majoritairement protonées à un pH inférieur à 6, mais seule la forme déprotonée est chimiquement réactive :

Si le pH est fixé à une valeur pour lequel la fonction α-amino est plus déprotonées que les fonctions ε-amino, il est envisageable de modifier sélectivement la fonction α-amino du résidu N-terminal. Ce serait une voie intéressante pour préserver la structure tridimensionnelle, puisqu’un seul résidu serait modifié. Toutefois, il est probable que la prépondérance numérique des groupes ε-amino accessibles (12 dans le cas de la BSA) anihile la réactivité supérieure du groupe α-amino.
La question est de savoir si la chimie des anhydrides modifie seulement la fonction amine N-terminal ou bien si elle modifie également les résidus Lysine. Les résidus Arginine contiennent une fonction guanidine nucléophile (Figure en annexe n° 5). Les variations du pH de réaction montrera dans quelle mesure la modification de ces résidus peut être limitée.
Conséquence pour l’intéraction antigène-anticorps
La question est de savoir si la modification chimique des fonctions amine peut altérer la liaison protéine-anticorps.
En effet, la structrure tridimensionnelle est maintenue d’une part grâce aux liaisons disulfure et d’autre part grâce aux liaisons électrostatiques auxquelles peuvent participer les fonctions amine. La modification chimique des fonctions amine pourraient bien en conséquence altérer la conformation de la protéine et donc sa capture par un anticorps.
Un moyen de connaître l’altération de la conformation de la protéine modifiée est une expérience de dichroïsme circulaire.
Le recouvrement ou le non-recouvrement des épitopes de la protéine avec un anticorps particulier s’ils sont contigus et connus et des résidus Lysine ou Arginine modifiés, peut permettre en première approximation d’estimer le risque de voir l’intéraction immunospécifique perturbée.
Une cartographie des épitopes4 de BSA a été réalisée dans le cas de 2 anticorps « AB3 » et « AB6 » produits par le laboratoire à l’origine de l’étude. Pour l’anticorps AB3, l’épitope réside dans le résidu Met-546 et les acides aminés proches (épitope contigu). Pour l’anticorps AB6, l’épitope, également de forme contigue, réside dans le peptide [299-338].
L’objectif du projet n’est pas de déterminer des épitopes d’une protéine donnée, mais de vérifier que la spécificité d’un anticorps avec sa protéine n’est pas altérée par une modification chimique. Ceci est possible grâce à la mesure des constantes d’association entre une protéine et son anticorps sur l’instrument BIACORE (technologie Surface Plasmon Resonance).
Pour l’instant, nous formons l’espoir que la modification de quelques résidus ne modifient pas fondamentalement l’intéraction protéine-anticorps.
Problèmatique analytique : Localisation d’une modification chimique
La localisation d’une modification chimique dépend d’une bonne couverture de la séquence protéïque : en effet, si une endoprotéinase telle que la trypsine (Figure en annexe n° 7) produit des peptides recouvrant au mieux 40 % de la séquence, il n’en reste pas moins que la plupart de ceux-ci ne contiennent pas les acides aminés modifiés (dans le cas de la chimie des anhydrides).
D’où l’idée de recourir à plusieurs endoprotéinases complémentaires (
Figure en annexe n° 6) afin d’obtenir une bonne couverture séquentielle pour repérer les acides aminés modifiés.
A cela s’ajoute une contrainte supplémentaire : pour être observable en spectrométrie de masse MALDI-TOF, il est souhaitable qu’un peptide protéolytique ait une masse supérieure à 1300 Da. En effet, la région 200-1300 Da (parfois même jusque 1600 Da) comporte de nombreux pics d’agrégats matriciels5 (HCCA) et ces pics ne peuvent pas toujours être distingués des pics de peptides. Plusieurs facteurs influencent leur formation : présence de cations, rapport analyte/matrice (qui peut être très variable). Ces pics d’agrégats ne pouvant être éliminés systématiquement, seules les masses supérieures à 1300 Da seront employées.
Le choix de l’endoprotéinase permet de palier cette contrainte : moins une enzyme produit de coupures, plus les peptides sont longs et plus leur masse est grande (
Figure en annexe n° 6 et Tableau en annexe n° 1). Le nombre de coupures d’une enzyme est proportionnelle à la fréquence dans les protéines des acides aminés dont elle est spécifique (Tableau en annexe n° 2). Cette spécificité dépend pour certaines endoprotéinases du tampon, ce qui nous laisse un paramètre supplémentaire pour maîtriser la longueur des peptides produits : l’endoprotéinase Glu C6 produit des coupures après les résidus d’acide glutamique (E) dans le tampon bicarbonate d’ammonium et après les résidus d’acide glutamique (E) et d’acide aspartique (D) dans le tampon Phosphate. La longueur d’un peptide protéolytique dépend aussi du nombre de coupures oubliées par la protéase. L’endoprotéïnase Glu C oublient très peu de coupures, tandis que la trypsine, elle, en oublie fréquemment une ou deux (Voir RESULTATS). Les courtes durées de digestion et les faibles rapports (Voir RESULTATS) enzyme/protéine favorisent un grand nombre de coupures oubliées.
Notons que l’acétylation d’un résidu Arginine R (ou Lysine K) rendrait caduque une coupure spécifique d’une liaison R/X (ou K/X) par l’endoprotéinase Arg C (ou la trypsine), d’où l’intérêt pour l’endoprotéïnase Glu C.
L’obtention d’une bonne couverture de la séquence est donc essentielle. Cet impératif analytique n’est pas nouveau : il correspond aux objectifs classiques de la protéomique : l’identification de protéines dans les mélanges complexes.
En plus des facteurs déjà évoqués (variété, complémentarité, spécificité des endopro-téinases, durée de digestion et rapport enzyme/protéine), le recouvrement d’un maximum de peptides dépend aussi de la préparation des échantillons pour MALDI-TOF (purification par phase inverse pour l’élimination des réactifs et ions indésirables pour l’ionisation MALDI, méthode de déposition).
L’emploi de conditions stringentes dans la protéolyse ou de détergent sont souvent évoqués pour augmenter la couverture séquentielle de protéines particulières. L’emploi de DTT7 pour la réduction des ponts disulfure (et) d’iodoacétamide8,9 pour l’alkylation, de l’urée agissant comme chaotrope a été explorée sans avoir été systématiquement étudiée. L’emploi du détergent non ionique OGP10 (β-octyl glucopyrannoside), conseillé dans les opérations d’évaporation sous-vide (Speedvac) et en spéctrométrie de masse, a également été essayé. Il n’est pas apparu que l’emploi de DTT et d’iodoacétamide ou encore de l’OGP augmente la couverture séquentielle de la BSA. Le plus souvent les échantillons ont été dénaturés thermiquement à 90°C pendant 5-10 min11. De telles conditions stringentes ont été employées dans un but analytique : observer le plus possible de peptides modifiés. Une trop grande stringence pourrait être préjudiciable à la conservation d’un complexe anticorps-protéine. Des essais ont montré que la même couverture (en ce qui concerne BSA) a été obtenue sans dénaturation.
Méthodes expérimentales
Réactifs
La protéine BSA (Albumine de Serum Bovin ; Sigma A0271), les endoprotéinases Glu C (de source chaîne V8 de Staphyloccocus aureus ; Sigma P2922) et Arg C (glandes submaxillariennes de souris ; Fluka 45173) ont été fournis par SIGMA, la trypsine « sequencing grade » par PROMEGA.
Les anhydride acétique et propionique, les solvants THF, acétonitrile, propan-2-ol, méthanol, les tampons MES, HEPES, hydrogénophosphate de sodium, la matrice HCCA (acide alpha-cyano hydroxy-cinnamique) ont été fournis par ALDRICH. Le gel SEPHADEX G25 Fine provient de AMERSHAM BIOSCIENCES.
La résine échangeuse d’ion utilisée a été fournie par BIO RAD : il s’agit d’une résine AG 50W-X8 (100-200 mesh) sous forme d’ions Hydronium.
Détermination du nombre de résidus Lysine accessibles dans une protéine 12
Les résidus Lysine sont modifiés par le réactif TNBS (acide TrinitroBenzene-Sulfonic) en large excès dans un tampon tétraborate de sodium Na2B4O7 (0,1 M) dans la soude NaOH (0,1 M) (pH = 8). Pour 50 µL de protéine, utiliser 50 µL de tampon et 10 µL de réactif TNBS. Après 5 minutes, la réaction est arrêtée par addition de 200 µL de tampon dihydro-génophosphate de sodium NaH2PO4 (pH = 7) contenant du sulfite de sodium Na2SO3 (1,5 mM). Après dilution d’un tiers, l’absorbance à 420 nm (Voir RESULTATS est mesurée (Blanc : Même solution sans protéine).
Les groupes trinitrophenyl-amine forment un complexe avec l’ion sulfite. A 420 nm, le coefficient d’extinction molaire de ces groupes vaut 19 200 M-1.cm-1 (selon la référence 12).
Le nombre de résidus Lysine accessibles peut être calculé en fonction de la concentration initiale en protéine à partir de loi de Beer-Lambert.
avec : nombre de résidus Lysine accessibles ; ε : coefficient d’extinction molaire (19 200 M-1.cm-1) ; f : facteur de dilution (ici ).
Réaction chimique avec les anhydrides
La solution de protéine BSA (classée instable) est préparée chaque jour. Sa concentration est fixée à 100 pmol/µL et la réaction est effectuée sur 20 µL (2000 pmol). Les 2 anhydrides homologues sont dissous à la même concentration (42 pmol/µL) dans le solvant THF. Un aliquot (1 µL) ou plusieurs de ces 2 réactifs est ajouté à 2 échantillons contenant la même protéine à des concentrations diverses. La réaction est effectuée à température ambiante pendant une heure dans un tampon MES (pH=5.0 ; concentration finale = 0,1 mol/L). Le doublement de la concentration du tampon n’a pas d’influence sur l’avancement de la réaction. Aucune évolution de l’avancement de la réaction n’a été observée après une heure. Le mélange réactionnel est ensuite purifiée par filtration sur gel SEPHADEX G25 fine (400 µL). Le filtrat est ensuite stocké à – 20°C.
Digestion protéolytique
Chaque échantillon est dénaturé thermiquement à 90°C pendant 5-10 min avant digestion.
La digestion par la trypsine est effectuée dans un tampon bicarbonate d’ammonium (pH=8 ; concentration finale = 50 mM). La digestion par l’endoprotéinase Glu C se fait dans un tampon HEPES (pH=6 ; concentration finale = 50 mM) dans lequel les coupures sont attendues après l’acide glutamique (E) et l’acide aspartique (D). Le rapport enzyme/protéine est choisi égal à 1/40e (w/w).
La durée de digestion varie de 1 h à quelques heures pour l’endoprotéïnase Glu C et de 16 h pour la trypsine et l’endoprotéinase Arg C.
La température de digestion est de 37°C. Celle-ci doit être soigneusement notée, car le profil de digestion en dépend (observation faite avec l’endoprotéïnase Glu C).
Purification sur phase inverse des peptides protéolytiques.
Afin de retirer les divers contaminants rédhibitoires pour l’ionisation MALDI, les cônes ZIPTIP chargés en phase stationnaire C18 de la société MILLIPORE ont été utilisés. Les cônes ZIPTIP sont d’abord conditionnés avec l’acétonitrile (pour la rétention par partage hydrophobe) et avec l’acide trifluoroacétique TFA 0,1 % (pour la rétention par échange d’ion dynamique). Les échantillons sont acidifiés avec TFA 2% avant d’être retenus sur la phase stationnaire. Le lavage est fait à l’aide de TFA 0,1 %. Afin de recueillir le maximum de peptides, l’élution est réalisée dans un système binaire acétonitrile/eau avec 3 compositions différentes (10/90, 50/50, 90/10). Les 3 fractions sont ensuite regroupées pour être déposées sur la cible. L’analyte est donc dissous dans un système de solvant de composition finale 50/50.

La présence d’ions sodium Na+ (masse chimique = 22,98 Da), potassium K+ (masse chimique = 39,10 Da) conduit à la formation d’adduits cationiques avec un déplacement en masse de 22 Da pour le premier et de 38 Da pour le deuxième. De plus la formation d’un adduit avec un déplacement en masse de 56 Da souvent observé, correspondant à la formation de ce dernier adduit concordant avec le dépla-cement en masse produit par la propio-nylation.
Chacune des solutions utilisées dans la purification sur ZIPTIP (Acétonitrile, TFA) doivent donc être traitées par une résine échangeuse d’ion chargée en ions H+ afin d’éliminer la présence d’ion sodium Na+ et potassium K+.
Remarque : le traitement avec la résine échangeuse d’ions BIORAD d’un échantillon contenant des peptides conduit à la perte des peptides (probablement par absorption sur la résine).
Méthode de déposition sur cible pour MALDI-TOF
La méthode de déposition sur cible10,13-17 est la « méthode des 2 couches ». C’est une méthode hybride de la « méthode à évaporation rapide »18 et de la « méthode de la goutte séchée ». La « méthode à évaporation rapide » consiste en un dépôt d’une première couche de matrice et d’une deuxième couche d’analyte. La méthode de la goutte séchée consiste en un dépôt d’une seule couche d’un mélange matrice/analyte.
Dans la méthode utilisée dans ce travail, la première couche est constituée uniquement de matrice (HCCA, matrice acide, à 5 mg/ml dans un mélange de solvant acétone/méthanol (80/20 v/v) et la deuxième couche est un mélange de matrice et d’analyte (HCCA 5 mg/ml dans un mélange de solvant isopropanol/TFA 2% (50/50 v/v)). Le rapport analyte/matrice (v/v) généralement employé est égal à 4/1. Afin d’éviter la redissolution complète de la première couche d’HCCA (matrice hydrophobe) par l’acétonitrile contenu dans la solution d’analyte, celle-ci est préalablement appauvrie en acétonitrile par évaporation sous vide (Speedvac).
Spectres MALDI-TOF
Les spectres MS ont été enregistrés avec
un MALDI-TOF linéaire de marque BRUKER (modèle BIFLEX III) de résolution moyenne à mi-hauteur 250. Les échantillons ont été déposés sur une cible en Aluminium-Ni avec 386 positions. L’acquisition est réalisée de façon automatique. En général, 150-200 tirs ont été moyennés pour produire un spectre de masse. Chaque spectre a été normalisé en utilisant le signal le plus intense. Les ions ont été produits en mode positif avec une tension d’accéleration Uis1 = 20 kV et un délai d’extraction de 300 ns.
Logiciels d’identification des peptides
Les 2 logiciels utilisés pour l’identification des peptides à partir des masses expérimentales sont FINDPEPT de l’organisation SWISSPROT (serveur http://www.expasy.com) et ProteinProspector-MS FIT de l’université de San Francisco (serveur http://prospector.ucsf.edu/). Les 2 logiciels permettent d’identifier les peptides qui résultent de coupures spécifiques et non spécifiques et tient compte des modifications post-translationnelles. Le premier logiciel a l’avantage sur le deuxième de pouvoir identifier les modifications chimiques définies par l’utilisateur (acétylation : ajout de C2H2O ; propionylation : ajout de C3H4O).
Résultats
Couverture séquentielle de la BSA
La trypsine produit 9 peptides recouvrant 26 % de la séquence de la BSA (Figure en annexe n° 7 et Document 1 en annexe).
L’endoprotéïnase Glu C produit 5 peptides (Tableau 1 et Figure 5) recouvrant 20 % de la séquence (rapport enzyme/protéine = 1/40e w/w).

Peptide masse du
peptide Coupure
oubliée
155-164 1361,4 Da 0
165-176 1518,8 Da 0
191-206 1720,9 Da 1
232-250 2186,0 Da 0
424-448 2878,2 Da 0
Tableau 1 : peptides produits par l’endoprotéïnase Glu C
(1/40e w/w).
Dans le cas de rapport enzyme/protéine plus faible (1/400e w/w), l’endoprotéïnase Glu C produits deux nouveaux peptides sont recouverts, qui ont respectivement 1 et 3 coupures oubliées (Tableau 2). La couverture séquentielle avec l’endoprotéïnase Glu C passe alors de 20% à 23,5 %.

Peptide masse du
peptide Coupures
oubliées
304-319 1837,5 Da 3
(Figure en annexe n° 9)
232-253 2560,8 Da 1
(Figure en annexe n° 10)
Tableau 2 : peptides supplémentaires
produits par l’endoprotéïnase Glu C
(1/400e w/w).
L’endoprotéïnase Arg C produit 4 peptides (Figure en annexe n° 8) dont 2 ne correspondent pas à des coupures spécifiques. De ce fait, leur attribuer une séquence univoque sur la seule donnée de leur masse moléculaire est impossible. En effet il correspond 10 séquences possibles au peptide de masse 2016,0 Da et 3 séquences possibles au peptide de masse 2521,6 Da (Tableau en annexe n° 3).
La Figure 1 montre la superposition des couvertures séquentielles obtenues par les 3 endoprotéinases. La couverture totale est égale à 31 %.

Endoprotéinase
(T : Trypsine ;
G : Glu C ;
A : Arg C )
Peptide Masse Coupures
oubliées Séquence
Recouvrement
des couvertures
T 66-75 1163.3 Da 0 LVNELTEFAK

G 155-164 1361.4 Da 0 KKFWGKYLYE
T 156-167 1574.8 Da 2 KFWGKYLYEIAR

T 161-167 927.4 Da 0 YLYEIAR

G 165-176 1518.8 Da 0 IARRHPYFYAPE
T 168-183 2044.2 Da 1 RHPYFYAPELLYYANK

G 191-206 1720.9 Da 1 CCQAEDKGACLLPKIE
A 223-232 1137.2 Da 0 CASIQKFGER
G 232-250 2186 Da 0 RALKAWSVARLSQKFPKAE
G 232-253 2560.8 Da 1 RALKAWSVARLSQKFPKAEFVE
G 304-319 1837.5 Da 3 KPLLEKSHCIAEVEKD
G 318-337 2198.7 Da 0 KDAIPENLPPLTADFAEDKD
T 341-359 2299.8 Da 1 NYQEAKDAFLGSFLYEYSR

T 347-359 1567.3 Da 0 DAFLGSFLYEYSR

T 421-433 1479.3 Da 0 LGEYGFQNALIVR

G 424-448 2878.2 Da 0 YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE
A 437-451 1637.9 Da 0 KVPQVSTPTLVEVSR
T 508-523 1823.1 Da 0 RPCFSALTPDETYVPK

T 549-561 1486.6 Da 1 QTALVELLKHKPK
Figure 1 : couverture séquentielle de la BSA
(digestion par la trypsine, l’endoprotéïnase Glu C et l’endoprotéinase Arg C ).

Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA
L’absorbance à 420 nm a été mesurée (Figure 2) et le nombre de résidus Lysine accessibles dans la BSA calculé (Figure 3) pour 5 solutions de protéine BSA modifiée par TNBS de concentration initiale 20-40-60-80-100 pmol/µL.

Figure 2 : Absorbance à 420 nm du complexe trinitrophenyl-amine-ion sulfite.

Figure 3 : Nombre de résidus Lysine accessibles
dans la protéine BSA
Chimie des anhydrides
Dans la suite, les notations suivantes seront adoptées :
• NM : pic du peptide non modifié.
• A1 : Acétylation d’un résidu.
• A2 : Acétylation de 2 résidus.
• A3 : Acétylation de 3 résidus.
• P1 : propionylation d’un résidu.
• P2 : propionylation de 2 résidus.
• P3 : propionylation de 3 résidus.
Identification des peptides modifiés
Pour repérer les déplacements en masse + 42 Da et + 56 Da sans équivoque, (en l’absence de spectromètre de masse MS/MS), la protéine acétylée et la protéine propionylée sont digérées séparément. Ces deux contrôles sont comparés à la digestion du mélange des deux (Figure 4).

Figure 4 : Acétylation et propionylation
d’une même quantité de protéine
(tampon MES pH=5 ;
anhydride/protéine = 0,06).
Modification localisée sur le peptide
de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence
YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux.

La formation d’adduit cationique + 56 Da est illustrée ici par la présence d’un peptide de masse 2990,9 Da dont l’attribution est équivoque sans spectre MS/MS, puisqu’il correspond soit à la modification de 2 résidus du peptide de masse 2878,2 Da soit à la formation d’un adduit cationique +56 Da du peptide contenant un résidu modifié.

L’intensité du pic de rapport m/z = 2934 pourrait être soit diminuée par l’apparition d’adduit +56 Da du peptide de masse 2934 Da, soit augmentée par l’apparition d’adduit cationique + 56 Da du peptide de masse 2878,2 Da.

L’influence de la formation d’adduit cationique + 56 Da sur la quantification doit donc être étudiée (Voir « QUANTIFICATION RELATIVE SUR DES SOLUTIONS DE CONCENTRATION DIFFERENTES »).
Identification des résidus modifiés
La digestion par la trypsine de la BSA produit 9 peptides de masse supérieure à 900 Da dont 2 sont modifiés par la chimie des anhydrides (Figure en annexe n° 7). Pour le premier (Figure en annexe n° 11), 2 séquences sont possibles (Tableau 3). Pour la première séquence, le résidu modifié peut être identifié : il ne peut s’agir que du résidu K-100, car la modification du résidu R-105 rendrait caduque la coupure de la liaison R-105/E-106. Pour la deuxième séquence, il est peu probable que le résidu K-183 soit modifié, car il se trouve du côté C-terminal du peptide et cela correspondrait à une coupure non spécifique de la trypsine.

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
89-105 1 K-100
(R-105
à exclure)
Séquence :(K)/SLHTLFGDELCKVASLR/(E)
1889,0 Da(1 coupure oubliée)
169-183 0 K-183
Séquence : (R) HPYFYAPELLYYANK (Y)
1888.9 Da (0 coupures oubliées)
Tableau 3 : les 2 séquences possibles pour le peptide
de masse 1888,5 Da.
Pour le deuxième (Figure en annexe n° 12), le peptide non modifié n’est pas observé. Sa masse ne peut être déduite que par soustraction de 42 Da de la masse du peptide acetylé (2341,8 Da) ou de 56 Da de la masse du peptide propionylé (2356,8 Da) et donc les 2 séquences sont possibles (Tableau 4).

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
402-420 1 K-412
Séquence :(K)/HLVDEPQNLIKQNCDQFEK/(L)
2299.5 Da (1 coupure oubliée)
341-359 1 K-346
Séquence :(K)/NYQEAKDAFLGSFLYEYSR/(R)
2302.5 Da (1 coupure oubliée)
Tableau 4 : les 2 séquences possibles pour le peptide
de masse 2300 Da.
Dans ces 2 séquences possibles, les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Lysine.
La digestion par l’endoprotéinase Arg C produit 4 peptides (Figure en annexe n° 8) dont 3 sont modifiés par la chimie des anhydrides. Pour deux d’entre eux, la séquence n’est pas connue (Figure en annexe n° 13 et Figure en annexe n° 14) et pour le troisième (Figure en annexe n° 15), la séquence est connue et le résidu modifié peut ainsi être identifié : il ne peut s’agir que du résidu K-437, car la modification du résidu R-451 rendrait caduque la coupure de la liaison R-451/S-452 (Tableau 5).

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
437-451 1 K-437
(R-451
à exclure)
Séquence :(R)/KVPQVSTPTLVEVSR/(S)

Tableau 5 : le résidu modifié de séquence identifiable observé par digestion avec l’endoprotéïnase Arg C.
Les 5-8 peptides (selon les conditions expérimentales) produits par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C (et observés dans l’intervalle 900-3500 Da) sont modifiés par la chimie des anhydrides (Tableau 6 et Figure 5 plus loin).
Ces modifications touchent les peptides produits majoritairement par l’enzyme. C’est pourquoi la possibilité d’une quantification a été étudiée principalement avec cette endoprotéïnase.

Peptide Nombre de
résidus
modifiés Résidus
modifiés
155-164 1 K-155
K-157
K-161
165-176 2 R-167
R-168
191-206 2 K-197
K-204
304-319 2 K 304
K 309
K 318
232-250 2-3 R-232
R 241
K 235
K 245
K 248
424-448 1 R 433
R 436
K 437
Tableau 6 : les 10-11 résidus potentiellement modifiés dans le tampon MES observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C.
Dans les peptides [155-164] et [304-319], les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Lysines.
Dans le peptide [165-176], les résidus modifiés ne peuvent être que des résidus Arginine.
Le peptide [424-448] contient un résidu Lysine et 2 résidus Arginine. La modification exclusive du résidu K-437 est observée avec l’endoprotéinase Arg C. Les résidus Arginine ne sont donc pas modifiés.
Le peptide [232-250] contient 2 résidus Arginine et 3 résidus Lysine. Sur les 3 résidus modifiés, 2 possibilités s’offrent : il y a soit 3 résidus Lysine modifiés, soit 2 résidus Arginine et 1 résidu Lysine modifiés. Il se peut que ce soit les 3 résidus Lysine. Pour le confirmer, une expérience MS/MS est nécessaire.
Le Tableau 7 (plus loin) regroupe l’ensemble des modifications observées sous toutes conditions avec l’endoprotéïnase Glu C.

Figure 5 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Conditions de réaction : tampon MES : pH = 5 ; anhydride/protéine = 0,08 .
Conditions de digestion : enzyme/protéine = 1/40e w/w ; durée = 5h.

Séquence du peptide
non modifié
selon le logiciel FINDPEPT
Résidus
modifiés Peptide masse du
peptide
non modifié masse du
peptide
modifié déplacement
en masse modification
(E)/KKFWGKYLYE/(I) K-155
K-157
K-161 155-164 1361,4 Da → 1400,9 + 39,5 A1
→ 1440,9 + 79,5 A2
→ 1487,5 + 126,1 A3
→ 1417,8 + 56,4 P1
→ 1472,6 + 111,2 P2
? ? P3
(E)/IARRHPYFYAPE/(L) R-167
R-168 165-176 1518,8 Da → 1560,7 + 41,9 A1
→ 1574,8 + 56,0 P1
→ 1604,4 + 85,6 P2
→ 1632,9 + 114,1 P3
(E)/CCQAEDKGACLLPKIE/(T) K-197
K-204 191-206 1720,9 Da → 1763,8 + 42,9 A1
→ 1806 + 85,1 A2
→ 1778,7 + 57,8 P1
→ 1834,8 + 113,9 P2
(D)/KPLLEKSHCIAEVEKD/(A)
K 304
K 309
K 318 304-319 1837,5 Da → 1878,5 + 41,0 A1
→ 1891,1 + 53,6 A2
→ 1919,2 + 81,7 P1
→ 1947,6 + 110,1 P2
(E)/RALKAWSVAR
LSQKFPKAE/(F) R-232
K 235
K 245
K 248
R 241 232-250 2186,0 Da → 2228,4 + 42,4 A1
→ 2270,2 + 84,2 A2
→ 2311,8 + 125,8 A3
→ 2241 + 55,0 P1
→ 2297,9 + 111,9 P2
→ 2355,3 + 169,3 P3
(E)/KDAIPENLPP
LTADFAEDKD/ (V) K 318
K 336 318-337 2198,7 Da → 2241,2 + 42,5 A1
→ 2284 + 85,3 A2
→ 2254,9 + 56,2 P1
→ 2311,8 + 113,1 P2
(E)/RALKAWSVAR
LSQKFPKAEFVE/(V) R-232
K 235
K 245
K 248
R 241 232-253 2560,8 Da → 2601,7 + 40,9 A1
→ 2644,6 + 83,8 A2
→ 2591,1 + 30,3 A3
→ 2616,5 + 55,7 P1
→ 2672,8 + 112,0 P2
→ 2729,7 + 168,9 P3
(E)/YGFQNALIVRYT
RKVPQVSTPTLVE/(V) R 433
R 436
K 437 424-448 2878,2 Da → 2919,8 + 41,6 A1
→ 2964,1 + 85,9 A2
→ 3005,5 + 127,3 A3
→ 2935,5 + 57,3 P1
→ 2992,5 + 114,3 P2
→ 3049,9 + 171,7 P3
Tableau 7 : Modifications observées sous toutes conditions de réaction et de digestion
avec l’endoprotéïnase Glu C.

Influence du pH sur la réaction
L’influence du pH a été étudiée en comparant le tampon MES (pH = 5) aux tampons monohydrogénophosphate de sodium NaH2PO4 (pH = 8) et acide acétique/acétate de sodium AcOH/AcO- (pH = 4,5).
Une augmentation du pH déprotonent les fonctions amine primaire et les fonctions guanidine et les rendent plus nucléophiles :
dans le tampon NaH2PO4 (Tableau 8 et Figure en annexe n° 16, Figure en annexe n° 17, Figure en annexe n° 18)

Nombre de résidus modifiés
Peptide tampon
MES tampon
NaH2PO4 Résidus
potentiellement
modifiés
155-164 1 3 K-155
K-157
K-161
232-250 2-3 3 R-232
K 235
K 245
K 248
R 241
424-448 1 3 R 433
R 436
K 437
Tableau 8 : les résidus modifiés et observés dans le tampon monohydrogénophosphate observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C.
la conversion des fonctions amine en amide est plus grande (2 résidus Lysine supplémentaires sur le peptide [155-164] sont modifiés) et le nombre de résidus Arginine modifiés augmente (2 résidus Arginine supplémentaires sur le peptide [424-448] sont modifiés).
Dans les peptides [232-250], la conversion des 3 résidus modifiés est plus grande, sans qu’il y ait plus de résidus modifiés. Dans l’expérience décrite ici, tous les peptides n’ont pas été observés pour une raison liée probablement aux conditions de digestion et non aux conditions de réaction.

Inversement, une diminution du pH rend les fonctions amine primaire moins nucléophiles et l’avancement de la réaction est moins grand dans le tampon AcOH/AcO- que dans le tampon MES (Figure en annexe n° 19, Figure en annexe n° 20, Figure en annexe n° 21).

Remarquons que si la concentration en anhydride propionique augmente, on observe une augmentation du pic d’acétylation (Figure en annexe n° 22 en annexe) !
Le contrôle contenant la protéine, le tampon acétate de sodium/acide acétique et l’anhydride propionique montre une acétylation en plus de la propionylation (Figure en annexe n° 22).

Ce qui veut dire que l’acétate de sodium réagit avec l’anhydride propionique pour donner un anhydride mixte (acétopropionique) qui réagit ensuite en acétylant et non en propionylant la protéine (Figure en annexe n° 24).

La question est de savoir lequel des peptides modifiés permet d’obtenir la meilleure quantification relative.
Réactivités comparées des anhydrides homologues
Il est avant tout nécessaire de préciser dans quelle gamme de concentration le réactif anhydride doit être employer en mesurant son influence sur l’avancement de la réaction.
La réaction d’acétylation a été menée sur la même quantité de protéine en faisant varier la quantité d’anhydride (2, 3 et 4 µL).
Le tableau suivant donne le ratio molaire anhydride/protéine, ainsi que le ratio molaire anhydride/Lysine :

µL 2 3 4
0.04 0.06 0.08
0.42 0.63 0.85

3 peptides modifiés ont été pris en exemple : les peptides de masse 2878,2 Da (Figure en annexe n° 25), 1720,9 Da (Figure en annexe n° 26) et 1361,8 Da (Figure en annexe n° 27).
Deux rapports ont été calculés :
(rapport de l’intensité du pic du peptide acétylé sur l’intensité du pic du peptide non modifié) et (rapport de l’intensité du pic du peptide acétylé sur la somme des intensités des pics des peptides acétylé et non modifié) (Tableau 9 et Tableau 10).
La conversion du peptide [424-448] (2878,2 Da) suit une croissance monotone (sinon linéaire) avec l’augmentation de la concentration en anhydride. Par contre, la conversion des peptides [155-164] (1361,4 Da) et [191-206] (1720,9 Da) ne suit pas de croissance monotone.

En premier figure le rapport m/z du peptide non modifié (nm).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide acetylé (a).
m/z = 1361-1401 m/z = 1722-1764 m/z = 2878-2920

4 µL 0.68 0.99 3.09
3 µL 0.43 1.55 2.69
2 µL 0.86 0.83 1.45

Tableau 9 : Progression de la réaction d’acétylation
en fonction de la quantité d’anhydride
(mesuré par le rapport ).
En premier figure le rapport m/z du peptide non modifié (nm).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide acetylé (a).
m/z = 1361-1401 m/z = 1722-1764 m/z = 2878-2920

4 µL 0.41 0.50 0.76
3 µL 0.61 0.61 0.73
2 µL 0.45 0.45 0.59
Tableau 10 : Progression de la réaction d’acétylation
en fonction de la quantité d’anhydride
(mesuré par le rapport ).
Les 2 réactifs homologues ont la même réactivité vis à vis d’une protéine, si l’intensité du pic du peptide propionylé et l’intensité du pic du peptide acétylé sont les mêmes ou de qui revient au même si le rapport des deux est égale à 1 (Figure en annexe n° 28, Figure en annexe n° 29, Figure en annexe n° 30 et Tableau 11). Ceci n’est observé que sur le peptide [424-448] de plus grande masse (2878,2 Da) pour une quantité de réactif au moins supérieure à 0,06 fois celle de la protéine.
La question est maintenant de savoir si la quantification sur des solutions de concentration différente est possible.

En premier figure le rapport m/z du peptide acétylé (a).
En deuxième figure le rapport m/z du peptide propionylé(p).
peptide [155-164]
m/z = 1361-1401 peptide [191-206]
m/z = 1764-1777 peptide [424-448]
m/z = 2920-2935

4 µL 0.68 0.83 0.97
3 µL 0.43 0.85 0.99
2 µL 0.86 0.73 1.12
Tableau 11 : Réactivités comparées des 2 réactifs homologues
en fonction de la quantité d’anhydride.
Quantification relative sur des solutions de concentration différentes
La concentration de l’une des solutions de protéine a été fixée à 50 pmol/µL. Cette solution est prise pour réfé-rence. L’autre solution dont la concentration doit être déterminée a été obtenue par dilution de la précédente. Les concentrations préparées sont 10-20-30-40 pmol/µL. La quantité d’anhydride a été ajustée à la concentration de protéine
(1 aliquot pour 10 pmol/µL de protéine ; le rapport anhydride/protéine est constant et égal à 0,08).
Soit la solution référence a été propionylée, et la solution de concentration variable a alors été acétylée (Figure 7). Soit la solution référence a été acetylée, et la solution de concentration variable a alors été propionylée (Figure 8). Les 2 essais ont été soumis à 5 répétitions indépendantes et les mesures ont été éffectuées sur 2 spectromètres MALDI-TOF différents.
Dans le cas où la référence a été propionylée, le rapport expérimental (Tableau 12) sous-estime le rapport des concentrations des solutions formulées lorsqu’il est inférieur à 0,20 et il surestime ce rapport lorsqu’il est supérieur à 0,60.
Dans le cas où la référence a été propionylée, le rapport expérimental (Tableau 13) diffère de moins de 20 % du rapport des concentrations des solutions formulées.
Les résultats sont regroupés sur la Figure 6 :

Figure 6 : Rapports expérimentaux des intensités du pic correspondant
à la concentration variable sur le pic correspondant à la référence
en fonction du rapport formulé.

Figure 7 : Propionylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence).
Acétylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08).
(tampon MES pH=5).
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. concentration de protéine acétylée = 10 pmol/µL.
2. concentration de protéine acétylée = 20 pmol/µL.
3. concentration de protéine acétylée = 30 pmol/µL.
4. concentration de protéine acétylée = 40 pmol/µL.
5. concentration de protéine acétylée = 50 pmol/µL. Figure 8 : Acétylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence).
Propionylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08).
(tampon MES pH=5).
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
1. concentration de protéine propionylée = 10 pmol/µL.
2. concentration de protéine propionylée = 20 pmol/µL.
3. concentration de protéine propionylée = 30 pmol/µL.
4. concentration de protéine propionylée = 40 pmol/µL.
5. concentration de protéine propionylée = 50 pmol/µL.

Acetylation Propionylation
(Référence)
Expérimental
(spectromètre
1) Répétitions
Expérimental
(spectromètre
2) Répétitions
Formulé
Variance
intraclasse
= 0.08 14 degrés
de liberté Variance
intraclasse
= 0.06 17 degrés
de liberté
10 50 0.14±0.07 5 0.13±0.06 5 0.20
20 50 0.31±0.12 2 0.33±0.06 5 0.40
30 50 0.64±0.08 4 0.69±0.06 4 0.60
40 50 0.9±0.08 4 0.93±0.06 4 0.80
Tableau 12 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à l’acétylation
sur l’intensité du pic correspondant à la propionylation
en fonction du rapport des concentrations formulées.
(l’encadrement de la moyenne est calculé par un Student
à 14 et 17 degrés de liberté et avec une probabilité de 95 %).

Acetylation
(Référence) Propionylation
Expérimental
(spectromètre
1) Répétitions
Expérimental
(spectromètre
2) Répétitions
Formulé
(Variance
intraclasse
= 0.06) (8 degrés
de liberté) (Variance
intraclasse
= 0.07) (13 degrés
de liberté)
50 10 0.21±0.10 2 0.16±0.07 5 0.20
50 20 0.38±0.06 5 0.39±0.07 5 0.40
50 30 0.49±0.14 1 0.56±0.08 3 0.60
50 40 0.77±0.07 4 0.79±0.07 4 0.80
Tableau 13 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à la propionylation
sur l’intensité du pic correspondant à l’acétylation
en fonction du rapport des concentrations formulées.
(l’encadrement de la moyenne est calculé par un Student
à 8 et 13 degrés de liberté et avec une probabilité de 95 %).

Discussion
Couverture séquentielle et identification de résidus modifiés
La plupart des modifications ont été observées grâce à l’endoprotéïnase Glu C. La compréhension des conditions de protéolyse comme le rapport enzyme/protéine permet d’augmenter la couverture séquentielle et ainsi de gagner des informations sur les résidus potentiellement modifiés. L’endopro-téïnase Glu C n’oublient pas de coupures (Tableau 1), tandis que la trypsine en oublient fréquemment une ou deux. Lorsque le rapport enzyme/protéine est divisé par 10 (1/400e w/w), l’endoprotéïnase Glu C oublie plus de coupures (Tableau 2) et permet d’identifier d’autres résidus modifiés. Le peptide [232-253] contient 3 acides aminés de plus que le peptide [232-250] déjà observé avec un rapport enzyme/protéine 1/40e (w/w). L’identification de la séquence du peptide [232-250] et des résidus modifiés est ainsi confirmée (si besoin était). Le peptide [304-319] permet d’identifier 3 résidus potentiellement modifiés supplémentaires.
Une endoprotéinase doit produire des coupures spécifiques pour être exploitable avec un spectromètre MALDI-TOF linéaire, sinon l’éventail des séquences correspondant à une masse est trop large (Voir les coupures produites par l’endoprotéinase Arg C). La séquence pourrait être connue avec un spectromètre de masse MS/MS. La non-connaissance de la séquence d’un peptide n’exclut toutefois pas son utilisation à des fins de quantification.
Réactivité des fonctions amine
Sur 12 résidus modifiés dans le tampon MES et observés grâce aux 3 endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine, 2 possibilités s’offrent : soit 8 résidus Lysine et 4 résidus Arginine sont modifiés, soit 10 résidus Lysine et 2 résidus Arginine sont modifiés.
Localisation d’une modification
Les modifications de 8 ou 10 résidus sur les 12 résidus Lysine accessibles sont observées. Faute d’une couverture séquentielle faible (31 %), toutes les modifications n’ont probablement pas été localisées.
Sélectivité en fonction du pH
A pH = 5 (dans le tampon MES), la quasi-totalité des résidus Lysine accessibles sont modifiés par la chimie des anhydrides. Les résidus Arginine modifiés le sont faiblement à ce pH. Plus le pH est supérieur à 5, plus les résidus Arginine sont modifiés.
Quantification relative
Dans le cas de la protéine BSA, la quantification relative est satisfaisante sur le seul peptide [424-448] de masse 2878,2 Da. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque la référence (solution de plus grande concentration) a été acétylée. Les écarts observés sur l’essai pour lequel la référence a été propionylée peuvent être expliqués par la formation d’adduits +56 Da.
Conséquence pour l’intéraction immunospécifique.
Le recouvrement ou le non-recouvrement des épitopes connus de la protéine BSA avec les anticorps « AB3 » et « AB6 » déjà mentionnés avec les résidus Lysine et Arginine peut maintenant être estimé.
Pour l’anticorps AB3, l’épitope réside dans le résidu Met-546 (Tableau 14 plus loin) et les acides aminés proches. Aucune peptide ne contenant ce résidu n’a été observé. Le risque de voir l’intéraction immunospécifique avec AB3 perturbée par la chimie des anhydrides ne peut donc être connu. Pour l’anticorps AB6, l’épitope réside dans le peptide [299-338]. Une modification des peptides [304-319] et [318-337] obtenus par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C a été observée. Il y a donc un risque de voir l’intéraction immunospécifique avec AB6 perturbée par la chimie des anhydrides.
Conclusion – Objectifs
La faisabilité d’une modification de protéine d’une manière douce a pu être démontrée. Il est possible d’identifier et de quantifier de façon relative une protéine par spectrométrie de masse. L’expérience acquise montre qu’il faut étudier chaque protéine individuellement : modifier la protéine, mener les digestions protéolytiques, retrouver le ou les peptide(s) qui conduisent à une bonne quantification relative avec la chimie des anhydrides. Dans le futur, il est prévu d’étudier l’insuline, PSA (Peroxidase Prostate Spectific Antigen) et HRP (Horseradish Peroxidase).

Si la spécificité d’un anticorps donné avec une protéine est altérée par une modification chimique de celle-ci, il est envisageable de produire un anticorps spécifique de la protéine modifiée. Il faudra vérifier alors que la specificité est la même avec les deux protéines modifiées différentiellement. La spécificité de chaque anticorps devra être essayée indépendamment sur instrument BIACORE ou essai Western Blot.
Tous les outils sont maintenant disponibles pour l’union d’une quantification relative par modification chimique différentielle de protéines issues d’extraits cellulaires d’origine distincte et la séparation des protéines par intéraction immunospécifique (antigène-anticorps).
Il reste à élaborer d’autres coupures protéolytiques et chimiques possibles (coupure par le bromure de cyanogène CNBr, par l’acide formique HCOOH) et d’autres chimie de modification des protéines.

Epitopes Endoprotéinase
(T : Trypsine
G : Glu C
A : Arg C )
Peptide Résidu modifié Intensité
du pic
(f : faible
M : moyen
F : Fort)
T 66-75 f
T 89-105 ? K-100 M
G 155-164 K-155 / K-157 / K-161 M
T 156-167 f
T 161-167 f
G 165-176 R-167 / R-168 F
T 168-183 f
G 191-206 K-197 / K-204 f
T 198-211 f
T 205-218 f
A 223-232 M
G 232-250 R-232 / R-241
K-235 / K-245 / K-248 F
épitope
de AB6 299-338
G 304-319 K-304 / K-309 / K-318 M
G 318-337 K-318 / K-336 M
T 341-359 ? K-346 ? M
T 402-420 ? K-412 ?
T 421-433 F
G 424-448 R-433 / R-436 / K-437 F
A 437-451 K-437 f
T 508-523 M
T 549-561 M
épitope
de AB3 Met-546
Tableau 14 : Couverture séquentielle de la BSA,
peptides et résidus modifiés dans le tampon MES
et épitopes des anticorps AB3 et AB6.
(Les points d’interrogation signalent une séquence incertaine).

Bibliographie
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7. Cleland, W. W. Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH groups. Biochemistry 3, 480-482 (1964).
8. Sechi, S. & Chait, B. T. Modification of cysteine residues by alkylation. A tool in peptide mapping and protein identification. Anal Chem 70, 5150-8 (1998).
9. Boja, E. S. & Fales, H. M. Overalkylation of a protein digest with iodoacetamide. Anal Chem 73, 3576-82 (2001).
10. Gobom, J. et al. Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics. Anal Chem 73, 434-8 (2001).
11. Park, Z. Y. & Russell, D. H. Thermal denaturation: a useful technique in peptide mass mapping. Anal Chem 72, 2667-70 (2000).
12. Fields, R. The rapid determination of amino groups with TNBS. Methods in enzymology 25 (1972).
13. Sze, E. T., Chan, T. W. & Wang, G. Formulation of matrix solutions for use in matrix-assisted laser desorption/ionization of biomolecules. J Am Soc Mass Spectrom 9, 166-74 (1998).
14. Cohen, S. L. & Chait, B. T. Influence of matrix solution conditions on the MALDI-MS analysis of peptides and proteins. Anal Chem 68, 31-7 (1996).
15. Kussmann, M. & Roepstorff, P. Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS. Methods Mol Biol 146, 405-24 (2000).
16. Zhang, N., Doucette, A. & Li, L. Two-layer sample preparation method for MALDI mass spectrometric analysis of protein and peptide samples containing sodium dodecyl sulfate. Anal Chem 73, 2968-75 (2001).
17. Dai, Y., Whittal, R. M. & Li, L. Two-layer sample preparation: a method for MALDI-MS analysis of complex peptide and protein mixtures. Anal Chem 71, 1087-91 (1999).
18. Vorm, O., Roepstorff, P. & Mann, M. Improved resolution and very high sensitivity in MALDI TOF of matrix surfaces made by fast evaporation. Anal Chem 66, 3281-3287 (1994).

ZERZERI SAMI ANNEE 2001-2002

STAGE DE DESS « ANALYSE ET ETUDES STRUCTURALES
EN CHIMIE ORGANIQUE ET BIOLOGIQUE »

COMPARAISON QUANTITATIVE DE PROTEINE
PAR SPECTROMETRIE DE MASSE
(ANNEXES)

MAITRE DE STAGE : IVO GLYNNE GUT, PHD
HEAD OF TECHNOLOGY DEVELOPMENT
TELEPHONE : 01 60 87 83 59

CENTRE NATIONAL DE GENOTYPAGE
BATIMENT G2
2 RUE GASTON CREMIEUX
CP 5721
91057 EVRY CEDEX

Annexes

Figure en annexe n° 1 : processus analytique.

Figure en annexe n° 2 : Les anhydrides homologues acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da.

Figure en annexe n° 3 : Structure du réactif ICAT. Le réactif est composé de 3 éléments : un marqueur d’affinité (Biotine), une chaîne alkyle portant 8 isotopes purs H ou D et un groupe réactif des résidus thiols.

Figure en annexe n° 4 : Réaction des anhydrides avec la fonction amine N-terminal, les fonctions amine primaire du résidu Lysine et guanidine du résidu Arginine.

Figure en annexe n° 6 : coupures par les endoprotéïnases trypsin, Arg C, Glu C et Asp N du fragment 25-60 de la BSA.

Position de la position de la première coupure Nom de l’endoproteinase Séquence du peptide contenant le résidu
N-terminal Longueur du peptide en nb d’a.a. Masse du peptide [Da]
29 Trypsine DTHK 4 499.239
31 Glutamyl endopeptidase DTHKSE 6 715.314
35 Arg-C proteinase DTHKSEIAHR 10 1192.595
37 Asp-N endopeptidase DTHKSEIAHRFK 12 1467.758
Tableau en annexe n° 1 : longueur et masse des peptides produits
par les Endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine.

Nom de l’enzyme Spécificité de l’enzyme Fréquence des résidus dans BSA Nb. de coupures Positions des sites de coupures
Trypsine K,R 14 % 6 29 35 37 45 66 76
Glu C endopeptidase E,D 17 % 6 31 41 42 63 70 73
Arg-C proteinase R 3,9 % 1 35
Asp-N endopeptidase D 6,9 % 3 37 61 70
Tableau en annexe n° 2 : Nombre de coupures produites en fonction de la fréquence des résidus
et de la spécificité d’une endoprotéinase

Document 1: couverture séquentielle de la BSA obtenue grâce à la tryspine (26 %)
avec le logiciel Protein-Prospector-MS FIT
MS-Fit Search Results
Parameters
Database searched: SwissProt.8.17.2002
Digest Used: Trypsine
Max. # Missed Cleavages: 3
Peptide N terminus: Hydrogen
Peptide C terminus: Free Acid
Cysteine Modification: unmodified
Instrument Name: MALDI-TOF
Sample ID (comment): Magic Bullet digest
Minimum Matches: 4
Sort Type: Score Sort
Considered modifications: | Peptide N-terminal Gln to pyroGlu | Oxidation of M | Protein N-terminus Acetylated |
Min Parent Ion Matches: 1
MOWSE On: 1
MOWSE P Factor: 0.4
Detailed Results
1. 12/19 matches (63%).
Acc. #: P02769 Species: BOVIN Name: Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6)
Index: 79329 MW: 69294 Da pI: 5.8

m/z
Submitted MH+
Matched Delta
Da Modifications Start End Missed
Cleavages Database
Sequence
927.4185 927.4940 -0.076 161 167 0 (K) YLYEIAR (R)
1163.3385 1163.6312 -0.29 66 75 0 (K) LVNELTEFAK (T)
1479.3211 1479.7960 -0.47 421 433 0 (K) LGEYGFQNALIVR (Y)
1486.6313 1487.8950 -1.3 pyroGlu 549 561 1 (K)QTALVELLKHKPK(A)
1567.2930 1567.7433 -0.45 347 359 0 (K) DAFLGSFLYEYSR (R)
1574.8172 1573.8531 0.96 156 167 2 (K) KFWGKYLYEIAR (R)
1589.9195 1588.8555 1.1 198 211 2 (K) GACLLPKIETMREK (V)
1589.9195 1590.8638 -0.94 205 218 2 (K) IETMREKVLASSAR (Q)
1823.0762 1823.9002 -0.82 508 523 0 (R) RPCFSALTPDETYVPK (A)
1888.4944 1887.0711 1.4 212 228 3 (K) VLASSARQRLRCASIQK (F)
1888.4944 1888.9274 -0.43 169 183 0 (R) HPYFYAPELLYYANK (Y)
1888.4944 1888.9955 -0.50 89 105 1 (K) SLHTLFGDELCKVASLR (E)
1945.6345 1947.0928 -1.5 229 245 3 (K) FGERALKAWSVARLSQK (F)
2044.1906 2045.0285 -0.84 168 183 1 (R) RHPYFYAPELLYYANK (Y)
2299.8202 2301.0828 -1.3 341 359 1 (K) NYQEAKDAFLGSFLYEYSR (R)

Figure en annexe n° 7 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)

Masse
calculée différence
de masse
Séquence Peptide
Coupure
oubliée Positions
des résidus K et R
2521.16 -0.5 (P)LTADFAEDKDVCKNYQEAKDAF(L) 328-349
0 K-336 ; K-340; K-346
2521.16 -0.5 (L)TADFAEDKDVCKNYQEAKDAFL(G) 329-350
0 K-336 ; K-340; K-346
2521.43 -0.23 (R)/LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTK(V) 242-263
0 K-246 ; K-249; K-257 ; K-264
2015.86 -0.22 (L)TKVHKECCHGDLLECADD(R) 262-279
0 K-263 ; K-266
2015.87 -0.22 (E)CCAKDDPHACYSTVFDKL(K) 383-400
0 K-386 ; K-399
2015.91 -0.18 (G)DELCKVASLRETYGDMAD(C) 96-113
0 K-100 ; R-105
2015.91 -0.17 (C)VADESHAGCEKSLHTLFGD(E) 78-96
0 K-88
2015.94 -0.15 (A)EDKDVCKNYQEAKDAFL(G) 334-350
0 K-336 ; K-340; K-346
2015.97 -0.11 (T)LFGDELCKVASLRETYGD(M) 93-110
0 K-100 ; R-105
2016 -0.09 (S)FLYEYSRRHPEYAVSV(L) 353-368
1 R-359 ; R-360
2016.04 -0.05 (F)LSHKDDSPDLPKLKPDPN(T) 127-144
0 K-130 ; K-138; K-140
2016.04 -0.04 (C)PFDEHVKLVNELTEFAK(T) 59-75
0 K-65 ; K-75
2016.11 0.028 (R)/EKVLASSARQRLRCASIQ(K) 210-227
2 K-212 ;
R-208; R-219 ; R-221 ; R-223
Tableau en annexe n° 3 : Séquences possibles pour les peptides de masse 2016,0 Da et 2520,0 Da
(coupures non spécifiques)
(Différence de masse maximum de 0,5 Da).

Figure en annexe n° 8 : Digestion par l’endoprotéinase Arg C de la BSA
(Conditions de réaction : tampon MES : pH = 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)

Figure en annexe n° 9 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w)
du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1837,5 Da [ 304-319]
de séquence KPLLEKSHCIAEVEKD (3 coupures oubliées).
Résidus potentiellement modifiés : K-304 / K-309 / K-318.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)

Figure en annexe n° 10 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w)
du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2560.8 Da [ 232-253]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAEFVE (1 coupure oubliée).
Résidus potentiellement modifiés : R-232 / K-235 / R-241 / K-245 / K-248.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)

Figure en annexe n° 11 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1888,5 Da [89-105]
de séquence SLHTLFGDELCKVASLR.
Résidu potentiellement modifié : K-100
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux. Figure en annexe n° 12 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2300 Da [ 402-420]
de séquence HLVDEPQNLIKQNCDQFEK
ou [341-359] de séquence NYQEAKDAFLGSFLYEYSR.
Résidus potentiellement modifiés : K-412 ou K-346.
(Conditions de réaction : tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5 ; anhydride/protéine = 0,17.)
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.
3. Digestion du mélange des deux.

Figure en annexe n° 13 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 1639,5 Da [437-451]
de séquence KVPQVSTPTLVEVSR.
Résidus potentiellement modifiés : K-437.
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)

Digestion de la protéine non modifiée.
Digestion de la protéine acétylée seule.
Digestion de protéine propionylée seule. Figure en annexe n° 14 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2016,1 Da
de séquence inconnue (coupure non spécifique).
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,02.)
1. Digestion de la protéine non modifiée.
2. Digestion de la protéine acétylée seule.
3. Digestion de protéine propionylée seule.

Figure en annexe n° 15 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C
de la BSA modifiée.
Modification localisée sur le peptide de masse 2521,7 Da
de séquence inconnue (coupure non spécifique).
(Conditions de réaction : tampon MES : pH= 5 ; anhydride/protéine = 0,08.)
Digestion de la protéine non modifiée.
1. Digestion de la protéine acétylée seule.
2. Digestion de protéine propionylée seule.

Figure en annexe n° 16 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-232/K-235/R-241/K-245/K-248.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium : pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.
Figure en annexe n° 17 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium :
pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.

Figure en annexe n° 18 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. tampon monohydrogénophosphate de sodium : pH= 8.
2. tampon MES : pH=5.
Figure en annexe n° 19: Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448]
de séquence
YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE.
R-433/R-436/K-437.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.

Figure en annexe n° 20 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-197/K-204.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium :
pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.
Figure en annexe n° 21 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH.
1ère modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250]
de séquence RALKAWSVARLSQKFPKAE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-232/K-235/R-241/K-245/K-248.
2ème modification localisée sur le peptide de masse 2198,7 Da [318-337] de séquence KDAIPENLPPLTADFAEDKD.
Résidus potentiellement modifiés :
K 318/K 336.
1. tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5.
2. tampon MES : pH= 5.

Figure en annexe n° 22 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,02.
2. anhydride/protéine = 0,08.
3. anhydride/protéine = 0,17.
4. anhydride/protéine = 0,34. Figure en annexe n° 23 : Propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,02.
2. anhydride/protéine = 0,08.
3. anhydride/protéine = 0,17.
4. anhydride/protéine = 0,34.

Figure en annexe n° 24 : Les anhydrides propionique réagit avec le tampon acide acétique/acétate de sodium pour donner l’anhydride mixte acétopropionique qui acétyle le résidu Lysine.

Figure en annexe n° 25 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence GFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 26 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés : K-197/K-204
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Figure en annexe n° 27 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5).
Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 28 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448]
de séquence YGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVE.
Résidus potentiellement modifiés :
R-433/R-436/K-437.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Figure en annexe n° 29 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206]
de séquence CCQAEDKGACLLPKIE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-197/K-204.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08. Figure en annexe n° 30 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride.
Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164]
de séquence KKFWGKYLYE.
Résidus potentiellement modifiés :
K-155/K-157/K-161.
1. anhydride/protéine = 0,04.
2. anhydride/protéine = 0,06.
3. anhydride/protéine = 0,08.

Nom de l’enzyme
Spécificité de
l’enzyme Fréquence des résidus dans
BSA peptides produits en théorie
(avec
0 coupures oubliées) peptides produits expérimentalement
Trypsine K,R 14% 55 dont 34 ont une masse supérieure à 900 Da 9
de masse supérieure
à 900 Da
Glu C endopeptidase E,D 17% 53 dont 27 ont une masse supérieure à 900 Da 5
de masse supérieure
à 900 Da
Tableau en annexe n° 4 : Nombre de peptides produits en théorie et en pratique
par les protéases Trypsine et Glu C.
2880 424-448 YGFQNALIVRYTRKVPQVST PTLVE
2483 42-62 HFKGLVLIAFSQYLQQCPFD E
2348 211-231 KVLASSARQRLRCASIQKFG E
2186 232-250 RALKAWSVARLSQKFPKAE
2135 399-416 KLKHLVDEPQNLIKQNCD
1821 449-465 VSRSLGKVGTRCCTKPE
1805 503-518 SLVNRRPCFSALTPDE
1722 177-190 LLYYANKYNGVFQE
1686 475-488 YLSLILNRLCVLHE
1583 136-149 LPKLKPDPNTLCDE
1520 165-176 IARRHPYFYAPE
1362 364-375 YAVSVLLRLAKE
1362 155-164 KKFWGKYLYE
1294 555-565 LLKHKPKATEE
1286 544-554 KQIKKQTALVE
1285 595-607 GPKLVVSTQTALA
1255 388-398 DPHACYSTVFD
1147 88-97 KSLHTLFGDE
1072 197-206 KGACLLPKIE
1070 519-527 TYVPKAFDE
1047 348-356 AFLGSFLYE
1019 98-106 LCKVASLRE
983 73-81 FAKTCVADE
979 528-535 KLFTFHAD
944 357-363 YSRRHPE
911 495-502 KVTKCCTE
906 293-300 TISSKLKE
Tableau en annexe n° 5 : Peptides produits en théorie
par digestion par l’endoprotéïnase Glu C avec 0 coupures oubliées.

Table des figures

Figure 1 : couverture séquentielle de la BSA (digestion par la trypsine, l’endoprotéïnase Glu C et l’endoprotéinase Arg C ). 8
Figure 2 : Absorbance à 420 nm du complexe trinitrophenyl-amine-ion sulfite. 9
Figure 3 : Nombre de résidus Lysine accessibles dans la protéine BSA 9
Figure 4 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5 ; anhydride/protéine = 0,06). Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 9
Figure 5 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. 11
Figure 6 : Rapports expérimentaux des intensités du pic correspondant à la concentration variable sur le pic correspondant à la référence en fonction du rapport formulé. 16
Figure 7 : Propionylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence). Acétylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08). 17
Figure 8 : Acétylation d’une solution de concentration 50 pmol/µL de protéine (référence). Propionylation de solutions de protéine de concentrations diverses à rapport anhydride/protéine constant (0,08). 17

Tables des figures en annexe
Figure en annexe n° 1 : processus analytique. 24
Figure en annexe n° 2 : Les anhydrides homologues acétique et propionique réagissent avec la fonction amine primaire du résidu Lysine pour donner des déplacements en masse respectifs de 42 Da et de 56 Da. 24
Figure en annexe n° 3 : Structure du réactif ICAT. Le réactif est composé de 3 éléments : un marqueur d’affinité (Biotine), une chaîne alkyle portant 8 isotopes purs H ou D et un groupe réactif des résidus thiols. 25
Figure en annexe n° 4 : Réaction des anhydrides avec la fonction amine N-terminal, les fonctions amine primaire du résidu Lysine et guanidine du résidu Arginine. 25
Figure en annexe n° 6 : coupures par les endoprotéïnases trypsin, Arg C, Glu C et Asp N du fragment 25-60 de la BSA. 26
Figure en annexe n° 7 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. 28
Figure en annexe n° 8 : Digestion par l’endoprotéinase Arg C de la BSA 30
Figure en annexe n° 9 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w) du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 1837,5 Da [ 304-319] 31
Figure en annexe n° 10 : Digestion par l’endoprotéïnase Glu C (enzyme/protéine = 1/400e w/w) du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 2560.8 Da [ 232-253] 32
Figure en annexe n° 11 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 1888,5 Da [89-105] 33
Figure en annexe n° 12 : Digestion tryptique du mélange 50/50 de la BSA acétylée et de la BSA propionylée. Modification localisée sur le peptide de masse 2300 Da [ 402-420] 33
Figure en annexe n° 13 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 1639,5 Da [437-451] 34
Figure en annexe n° 14 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 2016,1 Da 34
Figure en annexe n° 15 : Digestion par l’endoprotéïnase Arg C de la BSA modifiée. Modification localisée sur le peptide de masse 2521,7 Da 35
Figure en annexe n° 16 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2186 Da [232-250] 36
Figure en annexe n° 17 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448] 36
Figure en annexe n° 18 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 37
Figure en annexe n° 19: Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 2878.2 Da [424-448] 37
Figure en annexe n° 20 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 38
Figure en annexe n° 21 : Acétylation d’une même quantité de protéine (anhydride/protéine = 0,08). Influence du pH. 38
Figure en annexe n° 22 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 39
Figure en annexe n° 23 : Propionylation d’une même quantité de protéine (tampon acide acétique/acétate de sodium : pH= 4,5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 39
Figure en annexe n° 24 : Les anhydrides propionique réagit avec le tampon acide acétique/acétate de sodium pour donner l’anhydride mixte acétopropionique qui acétyle le résidu Lysine. 40
Figure en annexe n° 25 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 41
Figure en annexe n° 26 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 41
Figure en annexe n° 27 : Acétylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 42
Figure en annexe n° 28 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 2878,2 Da [424-448] 42
Figure en annexe n° 29 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1720.9 Da [191-206] 43
Figure en annexe n° 30 : Acétylation et propionylation d’une même quantité de protéine (tampon MES pH=5). Influence de la quantité relative d’anhydride. Modification localisée sur le peptide de masse 1361.4 Da [155-164] 43

Index des tableaux
Tableau 1 : peptides produits par l’endoprotéïnase Glu C (1/40e w/w). 7
Tableau 2 : peptides supplémentaires produits par l’endoprotéïnase Glu C (1/400e w/w). 7
Tableau 3 : les 2 séquences possibles pour le peptide de masse 1888,5 Da. 10
Tableau 4 : les 2 séquences possibles pour le peptide de masse 2300 Da. 10
Tableau 5 : le résidu modifié de séquence identifiable observé par digestion avec l’endoprotéïnase Arg C. 10
Tableau 6 : les 10-11 résidus potentiellement modifiés dans le tampon MES observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 11
Tableau 7 : Modifications observées sous toutes conditions de réaction et de digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 12
Tableau 8 : les résidus modifiés et observés dans le tampon monohydrogénophosphate observés par digestion avec l’endoprotéïnase Glu C. 13
Tableau 9 : Progression de la réaction d’acétylation en fonction de la quantité d’anhydride (mesuré par le rapport ). 15
Tableau 10 : Progression de la réaction d’acétylation en fonction de la quantité d’anhydride (mesuré par le rapport ). 15
Tableau 11 : Réactivités comparées des 2 réactifs homologues en fonction de la quantité d’anhydride. 15
Tableau 12 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à l’acétylation sur l’intensité du pic correspondant à la propionylation en fonction du rapport des concentrations formulées. 18
Tableau 13 : Rapports expérimentaux de l’intensité du pic correspondant à la propionylation sur l’intensité du pic correspondant à l’acétylation en fonction du rapport des concentrations formulées. 18
Tableau 14 : Couverture séquentielle de la BSA, peptides et résidus modifiés dans le tampon MES et épitopes des anticorps AB3 et AB6. 21

Index des tableaux en annexe
Tableau en annexe n° 1 : longueur et masse des peptides produits par les Endoprotéïnases Glu C, Arg C et trypsine. 26
Tableau en annexe n° 2 : Nombre de coupures produites en fonction de la fréquence des résidus et de la spécificité d’une endoprotéinase 26
Tableau en annexe n° 3 : Séquences possibles pour les peptides de masse 2016,0 Da et 2520,0 Da (coupures non spécifiques) 29
Tableau en annexe n° 4 : Nombre de peptides produits en théorie et en pratique par les protéases Trypsine et Glu C. 44
Tableau en annexe n° 5 : Peptides produits en théorie par digestion par l’endoprotéïnase Glu C avec 0 coupures oubliées. 44

Index

absorbance 5, 10
acide acétique 14, 29, 34, 38, 39, 40, 41, 47
acide formique 21
adduit cationique +56 Da 11
adduits +56 Da 20
agrégats matriciels 4
antigène-anticorps 2, 3, 21
Arg C 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 20, 22, 27, 31, 35, 36
BIACORE 3, 21
CNBr 21
concentration du tampon 6
coupure non spécifique 11, 35, 36
coupures non spécifiques 30
Couverture séquentielle 7, 20, 22
détergent 4, 5
disulfure 2, 3, 5
DTT 1, 4, 5
durée de digestion 4, 6
enzyme/protéine 4, 6, 7, 8, 12, 20, 32, 33, 46
épitopes 3, 20, 22
FINDPEPT 7, 13
gels bidimensionnels 2
Glu C 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22, 27, 32, 33, 45
guanidine 3, 14, 26, 46
HCCA 1, 4, 5, 7
Horseradish Peroxidase 21
ICAT 2, 26
insuline 21
intéraction immunospécifique 2, 3, 21
iodoacétamide 5
matrice 4, 5, 7
méthode à évaporation rapide 7
méthode de la goutte séchée 7
méthode des 2 couches 7
monohydrogénophosphate 14, 37, 38, 48
MS FIT 7, 28
MS/MS 10, 12, 20
OGP 1, 5
Peroxidase Prostate Spectific Antigen 21
pH 3, 5, 6, 10, 12, 14, 18, 20, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44
phenylisothiocyanate 1
potassium K+ 6
Purification sur phase inverse 6
résidus Lysine accessibles 5, 10
résine échangeuse d’ion 5, 6
SEPHADEX G25 fine 6
sodium 5, 14, 29, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 47
sodium Na+ 6
stringence 5
température de digestion 6
TFA 6, 7
THF 1, 5, 6
trypsine 4, 20
urée 5
ZIPTIP 6

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